平成２８年３月８日判決言渡 平成２７年（行ケ）第１００４３号審決取消請求事件 口頭弁論終結日平成２８年２月４日判決 原告 キュアバック ゲーエムベーハー 訴訟代理人弁理士 原謙三 同福井清 同藤田けんじろう 同中尾守男 同青野直樹 同鶴田健太郎 同小池隆彌 同黒田敏朗 同長谷川和哉 被告 特許庁長官 指定代理人 田村明照 同高堀栄二 同井上猛 同金子尚人 主文 １ 原告の請求を棄却する。 ２ 訴訟費用は原告の負担とする。 ３ この判決に対する上告及び上告受理の申立てのための付加期間を３０日と定める。 主文 １ 原告の請求を棄却する。 ２ 訴訟費用は原告の負担とする。 - 2 - ３ この判決に対する上告及び上告受理の申立てのための付加期間を３０日と定める。 事実及び理由 第１ 請求特許庁が不服２０１３－１１６３６号事件について平成２６年１０月２０日にした審決を取り消す。 第２ 事案の概要 １ 特許庁における手続の経緯等(1) 原告は，発明の名称を「トランスフェクションおよび免疫活性化のためのＲＮＡの複合化」とする発明について，平成２０年９月４日を国際出願日とする特許出願（特願２０１０－５２３３２４号，優先権主張２００７年（平成１９年）９月４日・欧州特許庁（ＥＰ）。以下「本願」といい，優先権主張日を「本願優先日」という。）をした（甲１）。 原告は，平成２４年８月２８日付けで拒絶理由通知を受けたため，同年１１月２８日付けで，本願の願書に添付した特許請求の範囲について手続補正（甲５）をしたが，平成２５年２月８日付けで拒絶査定を受けた。 そこで，原告は，同年６月１９日，拒絶査定不服審判を請求するとともに，本願の願書に添付した特許請求の範囲について手続補正（以下「本件補正」という。甲２）をした。 (2) 特許庁は，上記請求を不服２０１３－１１６３６号事件として審理を行い，平成２６年１０月２０日，本件補正を却下した上で，「本件審判の請求は，成り立たない。」との審決（出訴期間９０日附加。以下「本件審決」という。）をし，同年１１月４日，その謄本が原告に送達された。 (3) 原告は，平成２７年３月４日，本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。 ２ 特許請求の範囲の記載- 3 -(1) 本件補正前のもの本件補正前（ただし，平成２４年１１月２８日付け手続補正による補正後。 月４日，本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。 ２ 特許請求の範囲の記載- 3 -(1) 本件補正前のもの本件補正前（ただし，平成２４年１１月２８日付け手続補正による補正後。 以下同じ。）の特許請求の範囲の請求項１の記載は，次のとおりである（甲５。以下，同請求項１に係る発明を「本願発明」という。）。 「【請求項１】１つ以上のオリゴペプチドと複合化された少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を包含する免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡであって，上記ＲＮＡと上記オリゴペプチドとが，これらの分子の非共有的な相互作用によって連結しており上記１つのＲＮＡ（分子）の，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）が，０．５～５０の範囲内にあって，上記オリゴペプチドは８～１５アミノ酸の長さであり，かつ以下の実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ （式Ｉ）によって表され，上記実験式において，ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８～１５であり，かつｌ，ｍ，ｎ，およびｏは，それぞれ独立して，０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，および１５から選択された任意の数値であり，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎの総含有量が，上記オリゴペプチドの全てのアミノ酸の少なくとも５０％に相当するように規定され；Ｘａａは，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎ以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択された任意のアミノ酸であり；さらにｘは，０，１，２，３，４，５，６，７，および８から選択された任意の数値であり，Ｘａａの総含有量が，上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないように規定された，- 4 -腫瘍または癌疾患，循環器病，感染症，（感 ５，６，７，および８から選択された任意の数値であり，Ｘａａの総含有量が，上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないように規定された，- 4 -腫瘍または癌疾患，循環器病，感染症，（感染性）ウイルス性疾患，自己免疫疾患，（単）遺伝子疾患，および／またはアレルギーから選択される疾病の処置および／または予防における治療用複合化ＲＮＡ。」(2) 本件補正後のもの本件補正後の特許請求の範囲の請求項１の記載は，次のとおりである（甲２。以下，同請求項１に係る発明を「本願補正発明」という。下線部は，本件補正による補正箇所である）。 「【請求項１】１つ以上のオリゴペプチドと複合化された少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を包含する免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡであって，上記ＲＮＡと上記オリゴペプチドとが，これらの分子の非共有的な相互作用によって連結しており上記１つのＲＮＡ（分子）の，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）が，０．５～５０の範囲内にあって，上記オリゴペプチドは８～１５アミノ酸の長さであり，かつ以下の実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ （式Ｉ）によって表され，上記実験式において，ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８～１５であり，かつｌ，ｍ，ｎ，およびｏは，それぞれ独立して，０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，および１５から選択された任意の数値であり，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎの総含有量が，上記オリゴペプチドの全てのアミノ酸の少なくとも５０％に相当するように規定され；Ｘａａは，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎ以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択された任意のアミノ酸であり；さらに プチドの全てのアミノ酸の少なくとも５０％に相当するように規定され；Ｘａａは，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎ以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択された任意のアミノ酸であり；さらに- 5 -ｘは，０，１，２，３，４，５，６，７，および８から選択された任意の数値であり，Ｘａａの総含有量が，上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないように規定され，上記複合化一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子），対，上記１つ以上のオリゴペプチドのモル比が，１：２５０以上であり，腫瘍または癌疾患，循環器病，感染症，（感染性）ウイルス性疾患，自己免疫疾患，（単）遺伝子疾患，および／またはアレルギーから選択される疾病の処置および／または予防における治療用複合化ＲＮＡ。」 ３ 本件審決の理由の要旨(1) 本件審決の理由は，別紙審決書（写し）記載のとおりである。要するに，①本願補正発明は，本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２００６／０４６９７８号公報（以下「引用例１」という。）に記載された発明及び本願優先日当時の技術常識に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法２９条２項の規定により，特許出願の際独立して特許を受けることができないものであるから，本件補正は，平成１８年法律第５５号による改正前の特許法１７条の２第５項において準用する同法１２６条５項の規定に違反するので，同法１５９条１項において読み替えて準用する同法５３条１項の規定により却下すべきものである，②本願発明は，引用例１に記載された発明及び本願優先日当時の技術常識に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであって，特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないものであるから，本願は拒絶されるべきであるという 明及び本願優先日当時の技術常識に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであって，特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないものであるから，本願は拒絶されるべきであるというものである。 (2) 本件審決が認定した引用例１に記載された発明（以下「引用発明」という。），本願補正発明と引用発明の一致点及び相違点は，以下のとおりである。 ア引用発明- 6 -「Ｐｏｒｔ－３ （ＨＩＶＴａｔ： ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，１００：１～１：１の範囲である複合体。」イ一致点「１つ以上のオリゴペプチドと複合化された少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を包含する複合化一本鎖ＲＮＡであって，上記ＲＮＡと上記オリゴペプチドとが，これらの分子の非共有的な相互作用によって連結しており上記オリゴペプチドは１３アミノ酸の長さであり，かつ以下の実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（式Ｉ）によって表され，上記実験式において，ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝１３であり，かつｌは６，ｍは２，ｎ，およびｏは０であり，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎの総含有量が，上記オリゴペプチドの全てのアミノ酸の少なくとも５０％に相当するように規定され；Ｘａａは，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，およびＯｒｎ以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択された任意のアミノ酸であり；さらにｘは５であり，Ｘａａの総含有量が，上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないように規定される複合化ＲＮＡ。」である点。 ウ相違点(ア) 相違点(1 された任意のアミノ酸であり；さらにｘは５であり，Ｘａａの総含有量が，上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないように規定される複合化ＲＮＡ。」である点。 ウ相違点(ア) 相違点(1)「複合化一本鎖ＲＮＡ」が，本願補正発明においては「免疫活性化」との性質を有し，「腫瘍または癌疾患，循環器病，感染症，（感染性）ウイルス性疾患，自己免疫疾患，（単）遺伝子疾患，および／またはアレ- 7 -ルギーから選択される疾病の処置および／または予防における治療用」に用いるものであることが特定されているのに対し，引用発明においては，緑色蛍光タンパク質をコードするものである点。 (イ) 相違点(2)複合体の１つのＲＮＡ（分子）の，１つ以上のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）が，本願補正発明においては，０．５～５０の範囲内であるのに対し，引用発明においては，１．１４であり，また，複合体の構成成分の複合比が，本願補正発明においては，「複合化一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子），対，上記１つ以上のオリゴペプチドのモル比が，１：２５０以上」であるのに対し，引用発明においては，１００：１～１：１（判決注 ＲＮＡ対オリゴペプチドのモル比という意味では，厳密には１：１～１：１００）の範囲である点。 第３ 当事者の主張 １ 原告の主張(1) 取消事由１（引用発明の認定の誤り）本件審決は，引用例１の記載から前記第２の３(2)アの引用発明を認定した。 しかしながら，以下のとおり，引用例１の記載から上記の引用発明を認定することは誤りである。 ア引用例１には，多くの形質転換の方法，治療プロトコル及び一般的な技術論が記載されているが，これらの記載を裏付ける実験データの記載はないから，引用例１の記 引用発明を認定することは誤りである。 ア引用例１には，多くの形質転換の方法，治療プロトコル及び一般的な技術論が記載されているが，これらの記載を裏付ける実験データの記載はないから，引用例１の記載は，単に理論上の可能性を示唆するにとどまる。 しかも，引用例１には，イン・ビボ条件における効果の記載もない。 なお，被告の主張するように，核酸とカチオン性ペプチドの複合体を用いることにより，トランスフェクションをすることは周知であり，ＧＦＰ- 8 -をコードするＲＮＡを対象の細胞に導入することはトランスフェクションによる遺伝子発現を観察するためによく用いられているが，ＲＮＡとペプチドとの複合体を作製して，その複合体を用いて，対象の細胞を形質転換するという方法を採用するに当たって，当該ＲＮＡをどのようなペプチドに複合化させても，必ず対象の細胞を形質転換できるわけではない。 したがって，実験的証拠の記載もない引用例１からは，形質転換できるという効果を奏する複合体が得られることや，仮に複合体が得られたとしても，引用例１に記載された性質を示すことは確認できないのであるから，引用例１には実施可能なものとして完成した発明が記載されているとはいえない。 イ引用例１には，本件審決で引用発明を認定する基礎となったＰｏｒｔ－ ３ （ＨＩＶＴａｔ： ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）カチオン性ペプチド（以下「Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチド」ということがある。）以外にも多数のペプチドが記載されている上に，引用例１の実施例１の記載のみを参照しても，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチド以外に，本願補正発明の構成を有するものではない二つのペプチドが含まれている。 そうすると，引用例１の記載からＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドを選択することは当 ても，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチド以外に，本願補正発明の構成を有するものではない二つのペプチドが含まれている。 そうすると，引用例１の記載からＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドを選択することは当業者において容易ではなく，そのような特定は，後知恵によってのみ可能なものというべきであるから，引用例１に基づいて引用発明を認定することはできない。 (2) 取消事由２（相違点(1)の容易想到性の判断の誤り）ア本件審決は，相違点(1)につき，引用発明が細胞性免疫反応を誘導するものである一方，本願補正発明が有する性質は「生得の免疫反応を誘引する」等の限定を付すことなく，単に「免疫活性化」と特定されるものであるから，細胞性免疫反応の誘導をも包含するものであるとの判断を前提に，腫- 9 -瘍または癌疾患，感染症治療，（感染性）ウイルス性疾患などの処置，予防に有用な樹状細胞ワクチンを製造するために，引用発明の緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡに代えて，腫瘍細胞や病原体由来のｍＲＮＡを用いて，複合化一本鎖ＲＮＡを得ることは当業者が容易に想到することであり，このようにして得られた複合化一本鎖ＲＮＡは，樹状細胞に細胞性免疫反応を誘導させる性質，つまり，「免疫活性化」との性質を有するものであると判断した。 イしかしながら，本願の特許請求の範囲の請求項１にいう「免疫活性化」は，免疫反応を活性化する生得（抗原非依存性）の効果を指すために一般的に広く用いられる語であり，本願発明における「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」は，複合化一本鎖ＲＮＡがそれ自体で身体に対して非特異的な免疫活性効果を有するものを意味する。 このことは，本願の明細書（以下，本願の明細書と図面を併せて「本願明細書」という。）の実施例５及び図７において，ルシフェラーゼをコー 体で身体に対して非特異的な免疫活性効果を有するものを意味する。 このことは，本願の明細書（以下，本願の明細書と図面を併せて「本願明細書」という。）の実施例５及び図７において，ルシフェラーゼをコードするＲＮＡとノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）との複合体を，ヒトＰＢＭＣｓに触れさせると，ＴＮＦ－α等のサイトカインの生産及び分泌が生じているところ，これは，非特異的な免疫応答によるものか，又は，ＲＮＡ／ペプチド複合体自体が起因した生得の免疫応答による「免疫活性」の特徴的な性質であることや，本願明細書の段落【００６０】及び実施例５のとおり，本願補正発明は，ＲＮＡ／ペプチド複合体自体が，細胞質基質ではなくエンドソームの内部に存在するＴＬＲ受容体と結合することにより，特定のサイトカインを分泌することで，生得の免疫反応を引き起こすものであることからも明らかである。 ウこれに対し，引用例１には，実施例１に，ｍＲＮＡがコードするレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質）のＨｅＬａ細胞への輸送に関する記載があるにすぎないことからも明らかなように，細胞をトランスフェク- 10 -ションするためにカチオン性ペプチドを用いること，及びトランスフェクトされるｍＲＮＡから細胞質基質において翻訳されたタンパク質抗原が抗原提示細胞上に提示され，これにより免疫反応を引き起こすこと，すなわち従来から知られている抗原特異的な免疫応答が開示されているにとどまる。 エ以上のとおり，本願補正発明に係る免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡと，引用例１に開示されている複合体とでは，免疫を誘導するための機構が全く異なるから，当業者が引用例１に基づき本願補正発明の相違点(1)に係る構成を容易に想到し得たものということはできず，本件審決の判断は誤りである。 (3) 取消事由３（相違 誘導するための機構が全く異なるから，当業者が引用例１に基づき本願補正発明の相違点(1)に係る構成を容易に想到し得たものということはできず，本件審決の判断は誤りである。 (3) 取消事由３（相違点(2)の容易想到性の判断の誤り）本件審決は，相違点(2)に関し，引用例１の緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡについて，２３８アミノ酸において１個のアミノ酸につき３個のヌクレオチドが対応付けられている配列を開示する甲４を根拠として，「当該ｍＲＮＡの残基数が７００残基程度であることは本願優先日当時の技術常識である。」とした上で，カチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比が「１００：１」である場合，引用発明のＮ／Ｐ比は１．１４（＝８×１００／７００）となると認定した上で，複合体の効率的な複合体形成や導入のために，「複合化一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子），対，上記１つ以上のオリゴペプチドのモル比」を最適化し，１：２５０以上とすることや，複合体のカチオン性ペプチドの正電荷とＲＮＡの負電荷のバランスに着目して，複合体の「１つのＲＮＡ（分子）の，１つ以上のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）」のようなパラメータを設定，最適化し，これを０．５～５０の範囲内とすることは当業者が適宜行うことであり，本願明細書をみても，そのような数値限定をすることの臨界的意義は認められない旨判断した。 - 11 -しかしながら，以下のとおり，本件審決の判断は誤りである。 ア Ｎ／Ｐ比について(ア) Ｎ／Ｐ比は，ペプチド対ＲＮＡのモル比に対応するもので，ＲＮＡのモル量当たりのペプチドの数が掛け合わされた，複合タンパク質の正の荷電のアミノ酸（Ｎ）の数を，負の荷電である当該ＲＮＡのモル量当たりのリン酸（Ｐ）部分の数で割ることで ル比に対応するもので，ＲＮＡのモル量当たりのペプチドの数が掛け合わされた，複合タンパク質の正の荷電のアミノ酸（Ｎ）の数を，負の荷電である当該ＲＮＡのモル量当たりのリン酸（Ｐ）部分の数で割ることで定義される数値であり，ｍＲＮＡの長さ（リン酸部分の数で示されるヌクレオチドの数）は，ＲＮＡ分子によって定義されるＮ／Ｐ比の算出の決め手となることはよく知られている。 この点，引用例１には，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さについて一切記載がない上に，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは，コード領域のヌクレオチドの数に依存するだけでなく，ｍＲＮＡの５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域の長さにも依存することに照らすと，引用発明の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡについて，甲４を根拠として，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程度であることが本願優先日当時の技術常識であると認定することは誤りである。 そして，引用例１に基づいて導き出せる事項は，せいぜい，引用発明の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは，確実に７００塩基より極めて大きいであろうということだけにすぎないから，このような引用例１の開示事項から，本願発明の相違点(2)のＮ／Ｐ比に係る構成が示唆されることはない。 (イ) 本件審決は，本願補正発明のＮ／Ｐ比について臨界的意義が認められない旨判断している。 しかしながら，引用発明では，免疫反応に関して，抗原をコードする核酸で形質転換された細胞において，コードされた抗原を発現させるこ- 12 -とが記載されているのみであるのに対し，本願補正発明は，あらゆる抗原の発現及び提示を含まない，生得の免疫反応を引き起こすことを課題として，これを解決するものであり，その効果も開示されて 12 -とが記載されているのみであるのに対し，本願補正発明は，あらゆる抗原の発現及び提示を含まない，生得の免疫反応を引き起こすことを課題として，これを解決するものであり，その効果も開示されている。このように，本願補正発明と引用発明とでは，解決しようとする課題が異なり，得られる効果も異質であるから，引用発明に基づく本願補正発明の進歩性を判断するに際して，Ｎ／Ｐ比の値に関する臨界的意義を問題とする必要はない。 (ウ) 被告は，核酸を細胞にトランスフェクションする際，核酸をカチオン性ポリマーとの複合体とすること，及び，そのＮ／Ｐ比については，本願優先日前にすでに多数の文献（乙５ないし７）に記載されていたほか，核酸とカチオン性ペプチドとの複合体のＮ／Ｐ比として，０．５～５０の範囲内の数値である，例えば２～３程度の数値が，トランスフェクション効率の点で好ましいことが本願優先日前の周知事項であった（乙４，８，９）から，引用発明においてトランスフェクション効率を高めるために，Ｎ／Ｐ比を最適化し，０．５～５０の範囲内の数値とすることは，当業者であれば容易になし得ることである旨主張する。 しかしながら，被告が挙げる上記各文献に記載されたヌクレオチドは，引用発明のものよりも短かったり（乙７），トランスフェクトするヌクレオチドがＲＮＡでなくＤＮＡであったり（乙４，８，９）するもので，引用発明の複合体の構成要素とは異なる。そして，トランスフェクションのしやすさは，Ｎ／Ｐ比だけでは決定されず，複合体の大きさなど様々な要素が影響するものであるから，ある複合体についてトランスフェクションの効率上好ましいとされるＮ／Ｐ比を，トランスフェクションの対象が異なる別のものに適用することはできない。 したがって，被告の上記主張は あるから，ある複合体についてトランスフェクションの効率上好ましいとされるＮ／Ｐ比を，トランスフェクションの対象が異なる別のものに適用することはできない。 したがって，被告の上記主張は理由がない。 イ複合化一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子），対，上記１つ- 13 -以上のオリゴペプチドのモル比について，(ア) 引用例１は，ペプチド対ＲＮＡ複合体の比が１００：１～１：１の範囲にある，つまり，ＲＮＡ分子１個当たり，最大でもペプチドは１００個以下であると明確に記載しており，これ以外に数値範囲についての記載はない。しかも，引用発明における上記数値範囲は，本願補正発明と異なる引用例１記載の発明の目的である，細胞形質転換及び細胞サイトゾル内でのｍＲＮＡ翻訳（前記⑵ウ）に適合するよう設定されたものである。したがって，上記の数値は単なる例示ではなく，引用発明に接した当業者において，上記の数値を変更することはない。 仮に，引用発明の上記の数値範囲が単なる一例を示したものにすぎないとしても，相違点(2)の構成に係るモル比は，引用例１に記載された，トランスフェクションして生成されるタンパク質抗原による免疫誘導という課題ではなく，引用例１に記載のない，複合体自体がＴＬＲに結合することによる免疫活性という本願補正発明の課題を検討して初めて想到し得るものである。そうすると，引用発明に接した当業者において，引用発明のモル比につき，相違点(2)のモル比に係る構成とする動機付けがない。 したがって，引用発明から本願補正発明との相違点(2)の構成に係るモル比を想到することはできない。 (イ) 前記ア(ア)のとおり，引用例１記載の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは明らかではない。もっとも，甲４には，１０００塩基 の構成に係るモル比を想到することはできない。 (イ) 前記ア(ア)のとおり，引用例１記載の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは明らかではない。もっとも，甲４には，１０００塩基よりわずかに大きい緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基長の開示があるから，仮に引用例１記載の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基長としてこれを用いるとしても，引用発明の複合体のＮ／Ｐ比を本願補正発明でおいて特定された０．５～５０の範囲とするためには，引用発明におけるＲＮＡとＰｏｒｔ－３カチオン性ペプ- 14 -チドの複合比は，少なくとも１：６２．５以上となり，引用発明の同比１：１～１：１００のうち，１：６２．５～１：１００というわずかな範囲でしか実現されず，それ以外の範囲では実現されない。 引用発明における緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さがより長ければ，本願補正発明において特定されたＮ／Ｐ比の範囲を満たすためのＲＮＡ１個に対するペプチドのモル比の範囲はさらに狭くなる。 そうすると，引用発明において，本願補正発明において特定されるようなＮ／Ｐ比の範囲となるようなモル比を選択するための具体的な教示があるということはできず，そのような選択は後知恵によってのみ可能というべきであるから，当業者は相違点(2)のモル比に係る構成を容易に想到し得ない。 (ウ)ａ 引用発明における抗原特異的な免疫反応の活性化の効果を奏するためには，ＲＮＡを当該ＲＮＡがコードしている抗原タンパク質に翻訳することを可能にするために，複合体が，細胞内で，翻訳機構（リボソーム）の存在する細胞質に輸送される必要がある。しかしながら，引用発明におけるＲＮＡ複合体のように，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項 ，翻訳機構（リボソーム）の存在する細胞質に輸送される必要がある。しかしながら，引用発明におけるＲＮＡ複合体のように，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）であるようにすると，そのような重い複合体は細胞質に到達できず，仮にイン・ビトロ等で人工的に細胞質に到達させたとしても，複合体中のＲＮＡが複合化しているペプチドに「遮蔽」されてしまい，細胞質内のリボソームがＲＮＡに翻訳可能なように結合できず，抗原が全く発現されないことが当業者において知られている。 そうすると，当業者において，引用発明のＲＮＡに対するペプチドのモル比を２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）とすることはない。 - 15 -なお，本願補正発明に係る免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡは，非特異的な（生得の）免疫反応を可能にするために，細胞の細胞質ではなく，ＴＬＲ７／８の存在する細胞のエンドソーム区画内に輸送される必要があるから，そのような効果を奏するために本願補正発明の構成が採用されているものである。 ｂ 被告は，本願明細書の実施例４及び図８において，ルシフェラーゼｍＲＮＡのノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）に媒介されるトランスフェクションにおけるルシフェラーゼの発現が示されており，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）であるような重いＲＮＡ複合体であっても，細胞質内のリボソームに到達することが示されている旨主張する。 確かに，イン・ビトロの実験においては，本願明細書の実施例４及び図８に示されるような結果となるものの，イン・ビボの条件では，これと異なり，その理由は不明であるものの，タンパク質は 。 確かに，イン・ビトロの実験においては，本願明細書の実施例４及び図８に示されるような結果となるものの，イン・ビボの条件では，これと異なり，その理由は不明であるものの，タンパク質は発現しないか，弱い発現が確認されるのみであることは，当業者において周知である（甲１０）。そして，実際に問題とすべきは，複合化ＲＮＡのイン・ビボにおける挙動であるから，本願明細書の上記記載は，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）であるような重いＲＮＡ複合体であっても，リボソームに到達することを示すものとはいえない。 したがって，被告の上記主張は理由がない。 (エ)ａ 本件審決は，モル比を１：２５０以上とすることにつき，臨界的意義は認められない旨判断している。 しかしながら，前記ア(イ)と同様の理由により，モル比の点について臨界的意義を問題とすべきでない。 - 16 -仮に臨界的意義を問題とすべきとしても，本願明細書の図７には，（Ａｒｇ）９：Ｌｕｃ－ＲＮＡの質量比１：２（ＲＮＡ分子１個当たりペプチド１９２個のモル比に対応する）～１０：１（ＲＮＡ分子１個当たりペプチド３８３３．８個のモル比に対応する）の複合体において，顕著に優れた生得の免疫活性効果を確認できる反面，質量比１：５（ＲＮＡ分子１個当たりペプチド７６．７個のモル比に対応する），１：８及び１：１０の複合体の場合にはその効果は顕著に低くなることが示されている。 さらに，本願明細書の実施例８，図１０及び図１１において，１個のＲＮＡ分子に対してペプチドを２５０個以上用いるという技術思想によって，極めて高い免疫活性効果が得られることが裏付けられているほか，実施例１１，図２１及び図２２にお 図１０及び図１１において，１個のＲＮＡ分子に対してペプチドを２５０個以上用いるという技術思想によって，極めて高い免疫活性効果が得られることが裏付けられているほか，実施例１１，図２１及び図２２において，引用例１で開示された最大値であるＲＮＡ１個当たりペプチド１００個というモル比では，対照系であるｗ／ｏＲＮＡと比較して免疫活性効果を一切示していない一方，ＲＮＡ１個当たりのペプチド数を増加させて，５００個から５０００個とした場合には，ＴＮＦα又はＩＬ－６サイトカインのそれぞれの発現によって示される免疫活性効果が大幅に増加することが示されている。 以上によると，モル比を１：２５０以上とすることの臨界的意義は明らかである上に，当該モル比によって得られる効果は引用発明から予測される範囲を超えた顕著な効果を奏する。 したがって，本件審決の上記判断は誤りである。 ｂ 被告は，本願補正発明における複合化一本鎖ＲＮＡは，その長さや配列の限定がなく，５～２００００という広範囲のヌクレオチドの長さのものを含む任意のＲＮＡであるから，前記ａの本願明細書の記載によっても，本願補正発明全体が同様の効果を奏するとはいえない旨- 17 -主張する。 しかしながら，ＴＬＲに結合するという生得の免疫活性の性質は，ＲＮＡの長さに依存するものではなく，本願補正発明の構成に依存するものであるから，被告の上記主張は理由がない。そもそも，審査の過程で述べられなかった理由を進歩性欠如の理由とすることは許容されるべきではない。 また，被告は，本願明細書の実施例８，図１０及び１１で用いられた免疫活性化複合化一本鎖は，本願補正発明の構成とは異なるものであるから，これらを根拠に本願補正発明の効果を主張することはできない旨主張する。 し ，本願明細書の実施例８，図１０及び１１で用いられた免疫活性化複合化一本鎖は，本願補正発明の構成とは異なるものであるから，これらを根拠に本願補正発明の効果を主張することはできない旨主張する。 しかしながら，原告の本願明細書の実施例８，図１０及び図１１に基づく主張は，ペプチドと複合した一本鎖ＲＮＡによって，抗原の発現を求めずに優れた生得の免疫活性を得るという課題について検討したからこそ，ペプチド：モル比が１：２５０以上という構成に想到したことを説明するためのものにすぎないから，被告の上記主張はその前提を欠くものである。 ２ 被告の主張(1) 取消事由１に対しア原告は，引用例１には，多くの形質転換の方法，治療プロトコル及び一般的な技術論が記載されているが，これらの記載を裏付ける実験データの記載はなく，したがって，引用例１の記載は，単に理論上の可能性を示唆するにとどまるのであって，引用例１からは，形質転換できるという効果を奏する複合体が得られることや，仮に複合体が得られたとしても，引用例１に記載された性質を示すことは確認できないから，実施可能なものとして完成した発明が記載されているとはいえない旨主張する。 しかしながら，本件審決は，引用例１の請求項２９（甲３の３１頁，甲- 18 -３の訳文である乙１の２７頁）及び実施例１（甲３の２７頁１５行～２８頁２行，甲３の訳文である乙１の２６～２７頁）に基づいて，「Ｐｏｒｔ－３ （ＨＩＶＴａｔ： ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，１００：１～１：１の範囲である複合体。」という物質を「引用発明」として認定したものであるそして， 質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，１００：１～１：１の範囲である複合体。」という物質を「引用発明」として認定したものであるそして，引用例１には，本願優先日前の技術常識に照らして，本件審決が引用発明として認定した複合体が製造できるように記載されており，引用発明は，仮定ではなく実態ある物として把握できる。 また，核酸とカチオン性ペプチドの複合体を用いることにより，トランスフェクションできることは周知技術であり（乙４，８，９），しかも，引用例１の実施例で用いられている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は，トランスフェクションによる遺伝子発現を観察するためによく用いられるレポータータンパク質であるから，たとえ引用例１に実験的証拠がないとしても，当業者は，引用例１の複合体が形質転換可能なものであることは，十分に理解できる。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 イ原告は，引用例１の記載から配列番号２９のペプチドを選択することは困難というほかないから，これに基づいて引用発明を認定することはできない旨主張する。 しかしながら，進歩性の判断は，従来技術における本願発明に最も近似する発明（主たる引用発明）から出発して，これに主たる引用発明以外の引用発明及び技術常識等を総合的に考慮して，当業者において，当該発明における，主たる引用発明と相違する構成に到達することが容易であったか否かによって判断するのが客観的かつ合理的な手法とされているとこ- 19 -ろ，本件審決は，進歩性判断の出発点となる引用発明として，「Ｐｏｒｔ－３ （ＨＩＶＴａｔ： ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であっ となる引用発明として，「Ｐｏｒｔ－３ （ＨＩＶＴａｔ： ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，１００：１～１：１の範囲である複合体」という，本願補正発明に最も近似する発明を認定したものである。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 (2) 取消事由２に対し原告は，「免疫活性化」は，免疫反応を活性化する生得（抗原非依存性）の効果を指すために一般的に広く用いられる語であり，本願発明における「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」は，複合化一本鎖ＲＮＡがそれ自体で身体に対して非特異的な免疫活性効果を有するものであるのに対し，引用例１には，細胞をトランスフェクションするためにカチオン性ペプチドを用いること，及びトランスフェクトされるＲＮＡ又はｍＲＮＡから細胞質基質において翻訳されたタンパク質抗原が抗原提示細胞上に提示され，これにより免疫反応を引き起こすこと，すなわち従来から知られている抗原特異的な免疫応答が開示されているにとどまるから，本願補正発明に係る免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡと，引用例１に開示されている複合体とでは，免疫を誘導するための機構が全く異なり，当業者が引用例１に基づき本願補正発明の相違点(1)に係る構成を容易に想到し得たものということはできない旨主張する。 しかしながら，本願の特許請求の範囲の請求項１には，「免疫活性化」を「非特異的免疫応答（抗原非依存性）」の誘導のみに限定する記載は存在しない。 また，「免疫活性化」という用語は，「免疫反応を活性化する」ことを意味し，ここで「免疫反応」とは，「免疫現象に関係のある物質や細胞の生体内および生体外での反応の総体． る記載は存在しない。 また，「免疫活性化」という用語は，「免疫反応を活性化する」ことを意味し，ここで「免疫反応」とは，「免疫現象に関係のある物質や細胞の生体内および生体外での反応の総体．免疫応答，抗原と抗体や補体との反応，免- 20 -疫応答によって生じた機能細胞と抗原との反応など．」（乙３）を意味するから，「免疫活性化」という用語は，細胞に形質転換で導入された核酸にコードされた抗原が発現することにより誘発されるもの，つまり，「抗原特異的免疫応答」の活性化も含むものであるとするのが通常の解釈である。 さらに，本願の特許請求の範囲の請求項１０の記載に照らすと，本願補正発明の複合化一本鎖ＲＮＡのＲＮＡは，腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡなどを包含し，本願補正発明の「免疫活性化」が，「抗原特異的免疫応答」による「免疫活性化」を包含することは明らかである。 加えて，本願明細書段落【００９２】，【０１７６】及び【０１９２】の記載に照らしても，本願補正発明の複合化一本鎖ＲＮＡは，「抗原特異的免疫応答」の活性化にも使用し得ることが明らかである。 なお，原告は，「免疫活性化」という表現は，免疫反応を活性化する，生得（抗原非依存性）の効果を指すために一般的に広く使用される旨主張するが，その根拠は何ら示されていない。 したがって，原告の本願発明の免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡと引用発明の複合体とでは，免疫系の根本的な免疫学的作用機序の観点から全く異なるとの主張は理由がなく，この主張を前提とする，引用例１から相違点(1)に係る構成を容易に想到することはできないとの主張も理由がない。 (3) 取消事由３に対しア Ｎ／Ｐ比について(ア) 原告は，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程 構成を容易に想到することはできないとの主張も理由がない。 (3) 取消事由３に対しア Ｎ／Ｐ比について(ア) 原告は，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程度であることが本願優先日当時の技術常識であるとの本件審決の認定は誤りであり，引用例１に基づいて導き出せる事項は，せいぜい，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの長さは，確実に７００塩基より極めて大きいであろうということだけにすぎないから，このように緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さを特定する記載すらな- 21 -い引用例１の開示事項から，本願発明の相違点(2)のＮ／Ｐ比に係る構成が示唆されることはない旨主張する。 しかしながら，本件審決は，引用発明の複合体のＮ／Ｐ比を最適化し，０．５～５０の範囲内とすることは当業者が適宜行うことであるとの判断をしているから，原告が誤りであると主張する点は本件審決の結論には影響しない。 また，核酸を細胞にトランスフェクションする際，核酸をカチオン性ポリマーとの複合体とすること，及び，そのＮ／Ｐ比については，本願優先日前にすでに多数の文献（乙５ないし７）に記載されていたほか，核酸とカチオン性ペプチドとの複合体のＮ／Ｐ比として，０．５～５０の範囲内の数値である，例えば２～３程度の数値が，トランスフェクション効率の点で好ましいことが本願優先日前の周知事項であった（乙４，８，９）。上記のような周知事項を考慮すれば，引用発明の複合体において，緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡに代えて，腫瘍細胞や病原体由来のｍＲＮＡを用いる際においても，トランスフェクション効率を高めるために，Ｎ／Ｐ比を最適化し，０．５～５０の範囲内の数値とすることは，当業者であれば容易になし得ることである。 したがって のｍＲＮＡを用いる際においても，トランスフェクション効率を高めるために，Ｎ／Ｐ比を最適化し，０．５～５０の範囲内の数値とすることは，当業者であれば容易になし得ることである。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 (イ) 原告は，引用発明と本願補正発明とでは，解決しようとする課題が異なり，得られる効果も異質であることを理由として，引用発明に基づく本願補正発明の進歩性を判断するに際して，臨界的意義は不要であると主張するが，前記(2)と同様の理由により，原告の上記主張はその前提を欠き理由がない。 イモル比について(ア) 原告は，引用例１において，ペプチド：ＲＮＡ複合体比が１００：１～１：１の範囲にあることを明確に記載しているから，引用発明の複- 22 -合体のＲＮＡ：ペプチドのモル比を１：２５０以上とすることは容易ではない旨主張する。 しかしながら，引用例１（甲３の２４頁１～５行，甲３の訳文である乙１の２３頁１４～２０行）には，「ＲＮＡの長さ，配列，及び，それらの濃度がカチオン性ペプチドとＲＮＡの比を決定するための関連要因である。効率的な複合体形成や導入のために比や濃度を最適化することは当業者にとって容易である。」という記載に続けて，「好ましい比は，ＲＮＡ分子に対してカチオン性ペプチドが１－１００」と記載していることから，当業者であれば，複合体のＲＮＡ：ペプチドのモル比を決定するにあたり，より優先されるべき事項は効率的な複合体形成や導入のための最適化であり，「ＲＮＡ分子に対してカチオン性ペプチドが１－１００」は単なる一例として記載されており，この範囲に限定されないと理解する。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 (イ) 原告は，引用例１は本願発明のＮ／Ｐ比の範囲に入るよう １－１００」は単なる一例として記載されており，この範囲に限定されないと理解する。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 (イ) 原告は，引用例１は本願発明のＮ／Ｐ比の範囲に入るようなモル比を選択するための具体的な教示をしていない旨主張する。 しかしながら，特定のカチオン性ペプチドと特定の核酸の複合体において，Ｎ／Ｐ比は，複合体を構成するカチオン性ペプチドと核酸との分子数の比，つまり両者のモル比に比例することになる。したがって，Ｎ／Ｐ比を最適化しようと思えば，必然的にモル比も最適化されることになる（なお，原告も平成２７年５月２２日付け原告第２準備書面第２(2)において，Ｎ／Ｐ比がペプチド対ＲＮＡのモル比に関連することを認めている。）。 したがって，引用発明におけるＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体において，緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡに代えて，腫瘍細胞や病原体由来- 23 -の特定のｍＲＮＡを用いる際，前記ア(ア)のとおり，トランスフェクション効率を高めるためにＮ／Ｐ比を最適化することが当業者であれば容易になし得ることである以上，それに伴って必然的に行われるペプチド対ＲＮＡのモル比の最適化も容易というべきである。 そして，核酸とカチオン性ペプチドとの複合体のＮ／Ｐ比として，例えば２～３程度の数値が，トランスフェクション効率の点で好ましいことが本願優先日前の周知事項であったところ，引用発明のＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドは，塩基性アミノ酸を８個含むためカチオン性ペプチド１分子当たりの塩基性アミノ酸の側鎖のＮの数は８個であることが特定される。そして，引用発明の複合体において，緑色蛍光タンパク質に代えて，引用例１に示され 基性アミノ酸を８個含むためカチオン性ペプチド１分子当たりの塩基性アミノ酸の側鎖のＮの数は８個であることが特定される。そして，引用発明の複合体において，緑色蛍光タンパク質に代えて，引用例１に示された腫瘍抗原の代表的なもの，例えば，メラノーマ細胞由来の抗原であるｇｐ１００，ＭＡＲＴ－１や，乳癌細胞由来の抗原であるＭＵＣ－１などのｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡは，いずれも１０００塩基以上であるから，これらのＲＮＡも１０００塩基以上となる（乙１０ないし１２）。そこで，引用発明の複合体において，緑色蛍光タンパク質に代えて，引用例１に示された腫瘍抗原の代表的なもののｍＲＮＡを用いる際，Ｎ／Ｐ比を２～３程度に最適化しようとすれば，ＲＮＡ：ペプチドのモル比は１：２５０以上に最適化される。 また，当業者であれば，核酸１分子当たりのリン酸基のＰの数が大きくなるほど，つまりはＲＮＡの長さが長くなるほど，ＲＮＡに対するペプチドのモル比も比例して大きくなることが理解できるところ，前記(ア)のとおり，当業者ならば，引用発明において複合体のＲＮＡ：ペプチドのモル比を決定するにあたり，より優先されるべき事項は効率的な複合体形成や導入であると理解するはずであるから，例えば，ＲＮＡの長さが１０００以上と長い場合には，「ＲＮＡ分子に対してカチオン性ペプチドが１－１００」との単なる一例の記載に拘泥することなく，ＲＮＡ- 24 -に対するペプチドのモル比を上記のとおり，１：２５０以上に最適化することに困難性はない。 (ウ) 原告は，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）である重いＲＮＡ複合体は，コードされた抗原を発現するためのＲＮＡを翻訳するリボソームに到達できないことは技術常識であるか ル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）である重いＲＮＡ複合体は，コードされた抗原を発現するためのＲＮＡを翻訳するリボソームに到達できないことは技術常識であるから，当業者は，引用発明において，ＲＮＡに対するペプチドのモル比を２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）とはしない旨主張する。 しかしながら，重い複合体であってもリボソームに到達することは，従来から知られており（乙４，８，９），複合体が重いからといって，リボソームに到達できないとはいえないし，そもそも，原告が主張するような技術常識は存在せず，現に，原告は，この点を裏付ける根拠を何ら示していない。 また，本願明細書の実施例４及び図８において，ルシフェラーゼｍＲＮＡのノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）に媒介されるトランスフェクションにおけるルシフェラーゼの発現が示されており，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）であるような重いＲＮＡ複合体であっても，リボソームに到達することは，本願明細書自体に示されている。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 (エ) 原告は，本願明細書の図７，実施例８，図１０，図１１，実施例１１，図２１及び図２２を根拠として，複合体のＲＮＡ：ペプチドのモル比を１：２５０以上とすることは，非特異的免疫応答（抗原非依存性）の誘導という点において，臨界的意義を有する旨主張する。 しかしながら，本願補正発明における一本鎖ＲＮＡは，本願の特許請求の範囲の請求項１において長さや配列が限定されておらず，本願明細- 25 -書の段落【００４７】，【００４８】に記載されているように，５～２００００という広範 ける一本鎖ＲＮＡは，本願の特許請求の範囲の請求項１において長さや配列が限定されておらず，本願明細- 25 -書の段落【００４７】，【００４８】に記載されているように，５～２００００という広範囲のヌクレオチドの長さのものを含む任意のＲＮＡであるから，本願明細書の図７，２１，２２に，ある特定の複合体のＲＮＡ：ペプチドのモル比を１：２５０以上とすることで原告が主張するような効果があることの記載があるからといって，本願発明全体が上記と同様な効果を奏することが示されているとはいえない。また，ＲＮＡの長さは，ＲＮＡに対するペプチドのモル比に大きく影響を与えるものであるから，このようなＲＮＡの長さが特定されない本願補正発明において，「ＲＮＡに対するペプチドのモル比が，１：２５０以上」との発明特定事項には，技術的意義は認められない。 なお，本願明細書の実施例８，図１０及び１１で用いられた免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡは，本願補正発明の構成とは異なるものであるから，これらを根拠に本願補正発明の効果を主張することはできない。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 第４ 当裁判所の判断 １ 本願補正発明について(1) 本件補正後の本願の特許請求の範囲の請求項１の記載は前記第２の２(2)であるところ，本願明細書（甲１）の発明の詳細な説明には，概ね以下の記載がある（下記記載中に引用する図面のうち，図７，８，１０，１１，２１，２２については別紙明細書図面を参照）。 ア 【０００１】本発明は，８～１５アミノ酸の長さであり，かつ式（Ａｒｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドと複合体を形成するＲＮＡ（分子）を少なくとも１つ含む複合化ＲＮＡに関する。さらに，本発 かつ式（Ａｒｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドと複合体を形成するＲＮＡ（分子）を少なくとも１つ含む複合化ＲＮＡに関する。さらに，本発明は，上記本発明の複合化ＲＮＡを利用することによって，細胞または生体をトランスフェクトする方法に関- 26 -する。また，本発明の開示内容には，上記本発明の複合化ＲＮＡを包含する薬学的組成物およびキット，ならびに，細胞，組織または生体をトランスフェクトするための上記本発明の複合化ＲＮＡの使用，および／または免疫反応を調節，好ましくは免疫反応を誘引または亢進するための上記本発明の複合化ＲＮＡの使用を含む。 【０００２】遺伝子を導入する方法によって患者の細胞または組織に核酸をトランスフェトすることは，分子医学の主要な方法であって，多数の疾病の治療および予防において重要な役割を果たす。核酸のトランスフェクト方法が，組織または生体の免疫刺激を起こすことがある。あるいは，もしくは，さらに，核酸のトランスフェクションに続いて，導入された核酸によりコードされる情報のプロセッシング，つまり所望のポリペプチドまたはタンパク質への翻訳が起こることがある。核酸としてのＤＮＡまたはＲＮＡは，遺伝子治療に代わるアプローチとなる。核酸のトランスフェクションにより，トランスフェクトされた核酸のタイプに依存して，調節，例えば遺伝子発現の抑制または促進が起こることもある。これらの核酸のトランスフェクションは，通常，遺伝子を導入する方法を使って実施される。 【０００８】タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は，細胞膜を貫通する能力を有し，それゆえに（マクロ）分子の細胞内への輸送を実現するので，「細胞貫通ペプチド」（…；ＣＰＰ）とも呼ばれることがある。ＣＰＰは低分子 タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は，細胞膜を貫通する能力を有し，それゆえに（マクロ）分子の細胞内への輸送を実現するので，「細胞貫通ペプチド」（…；ＣＰＰ）とも呼ばれることがある。ＣＰＰは低分子ペプチドであって，通常塩基性アミノ酸の含有量が多く，７～３０個のアミノ酸の長さを有する。ＣＰＰを介して細胞内へ輸送される上述のマクロ分子としては，ＤＮＡ，ｓｉＲＮＡ，またはＰＮＡ（ペプチド核酸）およびペプチドがあげられ，上記ＣＰＰは通常共有結合を介してこれらのマクロ分子に結合しており，細胞にトランスフェクトされる。細胞貫通ペプチ- 27 -ド（ＣＰＰ）は，薬理学的な関心の高い多様な分子の細胞内輸送を，ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ双方で媒介するために使用され，成果をおさめている。ただし，細胞への取り込みが生じるメカニズムは依然不明である。ＣＰＰ類は多種多様であり…またはカチオン性かつ親水性のアルギニンリッチ・ペプチド類などからなる。…ＣＰＰ類が細胞内へ取り込まれる一般的なメカニズムは不明なままであるが，ポリアルギニンの場合の取り込みメカニズムとしてエンドサイトーシスが提案されている。エンドサイトーシスとは，マクロ分子が細胞膜を通過せずに細胞に入る細胞プロセスであり，…。いかなる理論に縛られるわけではないが，エンドサイトーシス中，ＣＰＰによって複合化されたマクロ分子は，まず，ヘパラン（ＨＳ）を含めた，負に帯電した細胞表面のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ；ＧＡＧ）に結合する。そして，…エンドサイトーシスによって，例えば細胞外で細胞膜を上記ＣＰＰ結合マクロ分子を包むように折り畳むことによって，上記ＣＰＰ結合マクロ分子が細胞内に入る。この結果，ＣＰＰ結合マクロ分子が中に組み込れた袋状の小胞が形成される。後期エ えば細胞外で細胞膜を上記ＣＰＰ結合マクロ分子を包むように折り畳むことによって，上記ＣＰＰ結合マクロ分子が細胞内に入る。この結果，ＣＰＰ結合マクロ分子が中に組み込れた袋状の小胞が形成される。後期エンドゾームおよび／またはゴルジ体および／または小胞体（ＥＲ）を介するＣＰＰ結合マクロ分子の輸送によって，ＣＰＰ結合マクロ分子が細胞質内へ運搬される。この段階で，ＣＰＰが誘引した一過的な孔が脂質二重層に開くことがある。あるいは，ＣＰＰによって複合化されたマクロ分子が細胞内の他の場所へ，例えば特定の目的に要求される作用様式によっては，エンドゾーム内へ輸送されることもある。一例としてＴＬＲ－７受容体およびＴＬＲ－８受容体はエンドゾーム中に位置している。したがって，免疫活性化ＲＮＡを細胞にトランスフェクトするとエンドゾームへ輸送され，例えば（具体的な相互作用およびその相互作用のパートナーによっては）下記のＲＮＡリガンドによって免疫活性化される。 なお，上記免疫活性化ＲＮＡは，例えば，ＴＬＲ１からＴＬＲ１３（トー- 28 -ル様受容体：ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，ＴＬＲ５，ＴＬＲ６，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，ＴＬＲ９，ＴＬＲ１０，ＴＬＲ１１，ＴＬＲ１２，またはＴＬＲ１３）のリガンドから選択されたＴｏｌｌ（トール）様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）のリガンドである。 【０００９】上記において定義された細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）は当該技術分野において周知であり，広く議論されている。ただし，ペプチド，タンパク質，およびＤＮＡを積荷として輸送するために，これらのＣＰＰを（キャリアとして）使用することは確立されており，上記ＣＰＰは通常共有結合で積荷分子に連結されている。一方，ＣＰＰを使った細胞内部へのＲＮＡ輸送は，非常に限 荷として輸送するために，これらのＣＰＰを（キャリアとして）使用することは確立されており，上記ＣＰＰは通常共有結合で積荷分子に連結されている。一方，ＣＰＰを使った細胞内部へのＲＮＡ輸送は，非常に限られた事例数しか報告されておらず，特に低分子ＲＮＡ配列，例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ配列に限定されている。 【００１７】さらに，細胞へのトランスフェクションは，ＣＰＰをＲＮＡと組み合わせて使用することによって実施してもよい。ただし，ＲＮＡの細胞への輸送については，実施例がほんのわずかな件数しか実施されていない。その原因は，ＲＮＡの劣化が速いことと，複合体の安定性が低いことにあると考えられる。したがって，ＣＰＰを使ったＲＮＡのトランスフェクションは，比較的安定している二本鎖ＲＮＡ，例えばｓｉＲＮＡに限定されるようである。一例をあげると，Ｔｏｅｎｇｅｓｅｔａｌ．（ＲＮＡ（２００６）， １２：１４３１～１４３８）は，ｓｉＲＮＡと複合体を形成するステアリル化された８－アルギニン（Ａｒｇ）８を，低分子二本鎖ｓｉＲＮＡを海馬の神経細胞へｉｎｖｉｔｒｏ導入するために使用した。 Ｔｏｅｎｇｅｓｅｔａｌ．（２００６，前掲）の結果によれば，ｓｉＲＮＡの輸送またはその他のＲＮＡ分子の輸送には，キャリアペプチドの- 29 -ステアリル成分が必須であるように思われる。 【００１９】以上を要約すれば，マクロ分子を細胞内へ輸送することを目的としたＣＰＰまたはその他のキャリアペプチドの使用に関する基本的な事項を，ペプチドおよびＤＮＡ分子の場合について示した。二本鎖ｓｉＲＮＡの細胞貫通特性を開示した具体的な報告はほとんどない。 【００２０】ＲＮＡ導入は現代の分子医学では重要な道具である。また，ＤＮＡ分子は重大な問題を起こす可能性があるので，ＤＮＡ細胞トラ ｉＲＮＡの細胞貫通特性を開示した具体的な報告はほとんどない。 【００２０】ＲＮＡ導入は現代の分子医学では重要な道具である。また，ＤＮＡ分子は重大な問題を起こす可能性があるので，ＤＮＡ細胞トランスフェクションと比較して優れた性質を示す。例えば，ＤＮＡ分子を適用すると，そのＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる危険性がある。…逆に，これらの危険性は，ＤＮＡの替わりにＲＮＡ，特にｍＲＮＡを使用すれば発生しない。 例えば，ｍＲＮＡは宿主ゲノムに組み込まれない。また，転写の実行にはプロモーターなどのウイルス性配列が一切不要である。ＲＮＡの使用によって生じる欠点があるとすれば，ＤＮＡに比較して不安定であることがその原因となるかもしれない…。 イ 【００２１】ＲＮＡ分子自身は，上述のようにＤＮＡに比べて有利な特性を有するので，本発明の目的は，細胞内へのＲＮＡ輸送に適しており，かつ効率的なキャリアを提供することである。したがって，本発明は，効率的な細胞内へのＲＮＡトランスフェクションを可能にする溶液を提供する。 【００２３】本発明の文脈において，複合化ＲＮＡとは，本発明において定義するように，実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドでもって，ＲＮＡとオリゴペプチドとの間で非共有的複合体を形成することによって複合化- 30 -された，ＲＮＡ（分子），好ましくはｍＲＮＡであると理解すべきである。 ここで，“非共有的”とは，ＲＮＡとオリゴペプチドとが，これらの分子の非共有的な相互作用によって可逆的に連結しており，上記分子は共有結合以外の任意のタイプの電子相互作用によって，例えばファンデルワールス結合（つまり，上記複合化分子の不特定な引力から発生する弱い静電性の引 的な相互作用によって可逆的に連結しており，上記分子は共有結合以外の任意のタイプの電子相互作用によって，例えばファンデルワールス結合（つまり，上記複合化分子の不特定な引力から発生する弱い静電性の引きつけあい）によって，互いに連結していることを意味している。ＲＮＡと少なくとも１つのオリゴペプチドとの連結は，複合体の解離平衡状態にある。細胞内については，理論に縛られるわけではないが，ＲＮＡとオリゴペプチドとが解離した状態の方で平衡であるように思われる。 ウ 【００３７】別の好適な実施形態によれば，本発明の複合化ＲＮＡのオリゴペプチドは，上述の実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘによって表わされ，一般式Ａｒｇ９（Ｒ９とも称される），Ａｒｇ９Ｈｉｓ３（Ｒ９Ｈ３とも称される），Ｈｉｓ３Ａｒｇ９Ｈｉｓ３（Ｈ３Ｒ９Ｈ３とも称される），ＴｙｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇ９ＳｅｒＳｅｒＴｙｒ（ＹＳＳＲ９ＳＳＹとも称される），Ｈｉｓ３Ａｒｇ９ＳｅｒＳｅｒＴｙｒ（Ｈ３Ｒ９ＳＳＹとも称される），（ＡｒｇＬｙｓＨｉｓ）４（（ＲＫＨ）４とも称される），Ｔｙｒ（ＡｒｇＬｙｓＨｉｓ）２Ａｒｇ（Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒとも称される）からなる小群より選択される。一層好ましくは，これらの一般式は以下のように定義される。すなわち，Ａｒｇ９：Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ（配列番号２）Ａｒｇ９Ｈｉｓ３：Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ（配列番号３９）…エ 【００４７】本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，（好まし- 31 -くは，本発明に係る複合化ＲＮＡとして適用されるＲＮＡのタイプに依存して 配列番号３９）…エ 【００４７】本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，（好まし- 31 -くは，本発明に係る複合化ＲＮＡとして適用されるＲＮＡのタイプに依存して）任意の長さを有していてもよい。上記少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，トランスフェクトされるＲＮＡのタイプに応じて，５～２００００ヌクレオチドの長さ，さらに好ましくは５～１００００ヌクレオチドの長さ，または３００～１００００ヌクレオチドの長さ，一層好ましくは５～５０００ヌクレオチドの長さ，最も好ましくは２０～５０００ヌクレオチドの長さ，５０～５０００ヌクレオチドの長さ，１００～５０００ヌクレオチドの長さ，または３００～１００００ヌクレオチドの長さであってもよいが，これに限定されるものではない（下記の開示を参照）。 【００４８】本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，任意のＲＮＡであってもよく，好ましくは，低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチド（好適な長さは５～８０，さらに好ましくは２０～８０ヌクレオチド），コーディングＲＮＡ，免疫活性化ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，アンチセンスＲＮＡ，またはリボスイッチ，リボザイム，またはアプタマーである。ただしこれに限定されるものではない。さらに，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ（後者は２本の一本鎖ＲＮＡ（複数分子）が非共有的に連結しているのであるから，一種のＲＮＡ（単一分子）であるともみなすことができる）であってもよいし，あるいは，部分的な二本鎖ＲＮＡ（これは通常，長めの一本鎖ＲＮＡ分子と比較的低分子の一本鎖ＲＮＡ分子とによって形成されるか，あるいは，長さがほぼ等しく，一方の一本鎖ＲＮＡ分子がもう一方の一本鎖ＲＮＡ分子に対して部分的に相補的であり れは通常，長めの一本鎖ＲＮＡ分子と比較的低分子の一本鎖ＲＮＡ分子とによって形成されるか，あるいは，長さがほぼ等しく，一方の一本鎖ＲＮＡ分子がもう一方の一本鎖ＲＮＡ分子に対して部分的に相補的であり，それゆえ両者がこの領域において二本鎖ＲＮＡ分子を形成する２本の一本鎖ＲＮＡ分子によって形成される）であってもよい。好ましくは，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，一本鎖ＲＮＡである。本発明の複合化ＲＮＡの少- 32 -なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，さらに，環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡであってもよく，好ましくは直鎖ＲＮＡである。さらに好ましくは，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，（直鎖）一本鎖ＲＮＡである。本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ），メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ），好ましくはｍＲＮＡである。本発明では，これらのＲＮＡのどれが細胞にトランスフェクトされてもよい。本発明において，ｍＲＮＡは通常いくつかの構造的要素からなるＲＮＡであり，例えば，必要に応じて５’－ＵＴＲ領域が存在し，この上流にリボゾーム結合部位が配置され，さらにコード領域と，必要に応じて３’－ＵＴＲ領域とが続き，さらにポリＡ尾部（および／またはポリＣ尾部）が続く。ｍＲＮＡは，モノシストロン性ＲＮＡ，ジシストロン性ＲＮＡ，さらに多シストロン性ＲＮＡとして，つまり，１つ，２つ，またはそれ以上の個数のタンパク質のコード配列を担持するＲＮＡとして発生してもよい。ジシストロン性ｍＲＮＡまたは多シストロン性ｍＲＮＡ中のこのようなコード配列は，例えばここで定義されるように，少なくとも１つのＩＲＥＳ配列によって離間している。 担持するＲＮＡとして発生してもよい。ジシストロン性ｍＲＮＡまたは多シストロン性ｍＲＮＡ中のこのようなコード配列は，例えばここで定義されるように，少なくとも１つのＩＲＥＳ配列によって離間している。 【００４９】低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチド第１の実施形態において，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明において，低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，上記において定義された任意のＲＮＡを備えていてもよい。上記低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，好ましくは一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり，さらに好ましくは一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。上記低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，一層好ましくは，直鎖一本鎖ＲＮＡオリゴヌク- 33 -レオチドである。 【００５０】好ましくは，ここで使用される上記低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，一般にＲＮＡ分子に対して上記において定義された長さを有し，さらに好ましくは，５～１００，５～５０，または５，３０ヌクレオチドの長さ，あるいは，２０～１００，２０～８０，一層好ましくは２０，６０ヌクレオチドの長さである。低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，各種目的のために，例えば，（非特異的）免疫活性化，遺伝子の転写／翻訳の低減／抑制のために使用されてもよい。 【００５１】コーディングＲＮＡ第２の実施形態において，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，コーディングＲＮＡであってもよい。本発明の複合化ＲＮＡのコーディングＲＮＡは，上記において定義された任意のＲＮＡであってもよい。上記コーディングＲＮＡは，好ましくは一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであり，さらに好ましくは一本鎖ＲＮＡ，および／または環状Ｒ ーディングＲＮＡは，上記において定義された任意のＲＮＡであってもよい。上記コーディングＲＮＡは，好ましくは一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであり，さらに好ましくは一本鎖ＲＮＡ，および／または環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡ，さらに好ましくは直鎖ＲＮＡである。上記コーディングＲＮＡは，一層好ましくは（直鎖）一本鎖ＲＮＡである。上記コーディングＲＮＡは，最も好ましくは（（直鎖）一本鎖）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。 【００５２】上記コーディングＲＮＡは，さらに，タンパク質またはペプチドをコードしていてもよい。ただし，上記タンパク質またはペプチドは，例えば，治療上有効なタンパク質またはペプチド，腫瘍抗原，抗体，免疫活性化タンパク質またはペプチドなどから選択されたもの，もしくは特定の（治療目的の）用途に適した任意の他のタンパク質またはペプチドから選択され- 34 -たものであって，タンパク質をコードする上記少なくとも１つのＲＮＡ（分子）が細胞，組織，または生体に輸送され，それに続いてこの細胞，組織，または生体中でタンパク質が発現するものである（ただしこれに限定されるものではない）。 オ 【００５７】本発明において定義される複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされた治療上有効なタンパク質は，さらに，中心的な役割を果たす細胞内プロセス（例えばアポトーシス，細胞成長など）に対して，特に生体の免疫系に関連して影響を与え得るシグナル伝達の調節（抑制または活性化）などを通じて各種細胞内経路を調節する，タンパク質から選択されてもよい。これにより，例えばサイトカイン，リンフォカイン，モノカイン，インターフェロンなどの免疫調節物質が，本発明において定義される複合化ＲＮＡによって効率よく発現する。…【００５８】 選択されてもよい。これにより，例えばサイトカイン，リンフォカイン，モノカイン，インターフェロンなどの免疫調節物質が，本発明において定義される複合化ＲＮＡによって効率よく発現する。…【００５８】また，本発明において定義される複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされた治療上有効なタンパク質は，さらに，抗原特異的Ｔ細胞受容体をコードしていてもよい。Ｔ細胞受容体，すなわちＴＣＲ（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）とは，一般に，主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役目を担う，Ｔリンパ球（またはＴ細胞）の表面上で見られる分子である。Ｔ細胞受容体は，Ｔ細胞の９５％においてはα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体であり，一方，Ｔ細胞の５％はγ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有する。ＴＣＲが抗原およびＭＨＣと結合すると，関連する酵素，共受容体，および固有アクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的現象を介して，該ＴＣＲのＴリンパ球が賦活化される。したがって，これらのタンパク質は，特定- 35 -の抗原を特異的に標的とすることを可能にし，その標的指向性によって免疫系の機能性を支援する。したがって，これらの受容体をコードしている，本発明において定義される複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を投与することによって，ｉｎｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトする手法，または，好ましくは，ｅｘｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトする（例えば，ある免疫細胞を特異的にトランスフェクトする）手法の採用を検討する。導入されたＴ細胞受容体分子はＭＨＣ分子上の特定の抗原を認識し，これにより攻撃すべき抗原に対する免疫系の認識を支援する。 【００５９】本 胞を特異的にトランスフェクトする）手法の採用を検討する。導入されたＴ細胞受容体分子はＭＨＣ分子上の特定の抗原を認識し，これにより攻撃すべき抗原に対する免疫系の認識を支援する。 【００５９】本発明において定義される複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされた治療上有効なタンパク質は，さらに，アジュバントタンパク質を含んでいてもよい。この文脈において，アジュバントタンパク質は，好ましくは，本発明において定義される生来の免疫反応を誘発できる任意のタンパク質であると理解すべきである。好ましくは，この生来の免疫反応には，パターン認識受容体の賦活化が含まれ，パターン認識受容体としては，例えば，ヒトのトール様受容体ＴＬＲ１～ＴＬＲ１０またはマウスのトール様受容体ＴＬＲ１～ＴＬＲ１３から選択されたトール様受容体を含む，トール様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）ファミリーから選択された受容体があげられる。好ましくは，生来の免疫反応が哺乳類において，さらに好ましくはヒトにおいて誘発される。好ましくは，上記アジュバントタンパク質は，ヒトアジュバントタンパク質または病原性アジュバントタンパク質，特に細菌性アジュバントタンパク質から選択される。さらに，アジュバント効果に関与するヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡが共に使用されてもよい。 【００６０】ヒトアジュバントタンパク質は，本発明において定義される複合化ＲＮ- 36 -Ａの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされていてもよく，通常，生来の免疫反応，例えば，外因性ＴＬＲリガンドがＴＬＲに結合する反応を（哺乳類において）誘発できる任意のヒトタンパク質を含む。さらに好ましくは，本発明の複合化ＲＮＡによってコードされたヒトアジュバントタンパク質は，以 ば，外因性ＴＬＲリガンドがＴＬＲに結合する反応を（哺乳類において）誘発できる任意のヒトタンパク質を含む。さらに好ましくは，本発明の複合化ＲＮＡによってコードされたヒトアジュバントタンパク質は，以下に列挙するものからなる群より選択される（ただしこれに限定されるものではない）。すなわち，ＩＬ－２，ＩＬ－１２，ＩＬ－１５，ＩＬ－１８，ＩＬ－２１ＣＣＬ２１，ＧＭ－ＣＳＦ，およびＴＮＦαを含む，生来の免疫反応を誘引または亢進するサイトカイン；ＩＬ－１，ＩＬ－６，ＩＬ－８，ＩＬ－１２，およびＴＮＦαを含む，マクロファージから放出されるサイトカイン；Ｃ１ｑ…を含む補体系の成分；ＴＬＲおよびＩＬ－１Ｒ１を含む，上記パターン認識受容体のシグナル伝達ネットワークの成分であるタンパク質…；ＩＬ－１ＲＩ，ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，ＴＬＲ５，ＴＬＲ６，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，ＴＬＲ９，ＴＬＲ１０，およびＴＬＲ１１を含む受容体；…である。 【００６１】病原性アジュバントタンパク質は，本発明において定義される複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされていてもよく，通常，生来の免疫反応を（哺乳類において）誘発することが可能な任意の病原性（アジュバント）タンパク質を含む。さらに好ましくは，上記病原性アジュバントタンパク質は，細菌，原虫，ウイルス，または菌類，動物などに由来する病原性（アジュバント）タンパク質から選択され，一層好ましくは，細菌性タンパク質，原虫タンパク質（例えば，トキソプラズマ原虫のプロフィリン様タンパク質），ウイルス性タンパク質，または真菌タンパク質，動物タンパク質などからなる群（ただしこれに限定されるものではない）より選択される病原性アジュバントタンパク質から選択される。 - 37 -カ 【００７０ パク質，または真菌タンパク質，動物タンパク質などからなる群（ただしこれに限定されるものではない）より選択される病原性アジュバントタンパク質から選択される。 - 37 -カ 【００７０】他の構成としては，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，抗原をコードしていてもよい。本発明では「抗原」という用語は，免疫系によって認識され，例えば抗体を形成することによって抗原特異的な免疫応答を誘発できる物質を指す。抗原はその起源によって分類できる。 この分類によれば，抗原には，外因性抗原と内因性抗原の２つの主なクラスがある。外因性抗原は，例えば，吸入，摂取，または注射などによって（細胞または身体の）外部から細胞または身体に入る抗原である。これらの抗原は，抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ；“ＡＰＣ”，例えば樹状細胞またはマクロファージ）によって内在化され，処理されて断片を形成する。そしてＡＰＣは，その表面上においてＭＨＣＩＩ分子を使用することによって，ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋）に断片を提示する。これらの抗原断片がＴ細胞によって認識されると，Ｔ細胞が活性化され，サイトカインが分泌される。サイトカインとは，免疫細胞，例えば細胞傷害性Ｔ細胞，Ｂ細胞，またはマクロファージの増殖を賦活する物質である。一方，内因性抗原とは，例えば正常な細胞の代謝の結果として細胞内部で生成された抗原である。これらの抗原の断片がＡＰＣの表面上のＭＨＣＩ分子に提示される。これらの抗原は，賦活化された抗原特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。認識後，上記Ｔ細胞は，抗原提示細胞の溶解またはアポトーシスを引き起こす異なる毒素を分泌しながら反応する。内因性抗原としては，抗原，例えば，その細胞自身 細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。認識後，上記Ｔ細胞は，抗原提示細胞の溶解またはアポトーシスを引き起こす異なる毒素を分泌しながら反応する。内因性抗原としては，抗原，例えば，その細胞自身の遺伝子情報によってコードされたタンパク質またはペプチドだけではなく，細胞内部の外来性核酸によってコードされたタンパク質またはペプチドをも含み，さらに，細胞内で発生するウイルス起源の抗原をも含む。内因性抗原の分類の１つが，腫瘍抗原の分類である。 これらの抗原は，腫瘍細胞の表面上のＭＨＣＩ分子によって提示される。 - 38 -この分類は，さらに，腫瘍特異的抗原（ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡｓ）と腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）とに分類され得る。ＴＳＡは腫瘍細胞によってのみ提示され，正常で“健康な”細胞によって提示されることは決してない。ＴＳＡは通常，腫瘍特異的な変異の結果生じる。ＴＡＡは，ＴＳＡより一般的に見られ，通常，腫瘍細胞と健康な細胞の双方によって提示される。これらの抗原は認識され，抗原提示細胞は細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊され得る。また，腫瘍抗原は，腫瘍の表面上においても，例えば変異型受容体の形態で発生可能である。この場合，腫瘍抗原は抗体によって認識され得る。 【００７３】抗原は，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）によってコードされていてもよく，典型的には，例えば特定の目的に適した任意の抗原（例えば本発明において定義される例えば特定の感染性疾病に関連した（または該感染性疾病を引き起こす）抗原），癌抗原（例えば腫瘍特異的な表面抗原），癌疾患において発現する抗原，癌疾患において発現する変異抗原，または，その他の疾病（例えば自己免疫 染性疾病に関連した（または該感染性疾病を引き起こす）抗原），癌抗原（例えば腫瘍特異的な表面抗原），癌疾患において発現する抗原，癌疾患において発現する変異抗原，または，その他の疾病（例えば自己免疫疾患，アレルギーなど）の原因に関わるタンパク質抗原から選択されてもよいが，これに限定されるものではない。例えば，患者にアレルギーまたは自己免疫性状態を引き起こす抗原を投与することによって患者を脱感作するために，これらの抗原を使用してもよい。 キ 【００９２】免疫活性化ＲＮＡ第３の実施形態によれば，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，免疫活性化ＲＮＡであってもよい。こうすることによって，免疫活性化ＲＮＡは，上記において定義された式（Ｉ）（判決注式- 39 -（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）。；（Ｘａａ）ｘのこと【００３４】）によって表わされる本発明のオリゴペプチドでＲＮＡを複合化する以前に，すでに免疫活性効果を示す。または，さらに好ましくは，ここで使用される上記ＲＮＡの免疫活性効果は，上記において定義された式（Ｉ）によって表わされる本発明のオリゴペプチドでＲＮＡを複合化することによって，亢進またはさらに誘引される。本発明の複合化ＲＮＡの免疫活性化ＲＮＡは，任意のＲＮＡ，例えば上記において定義されたコーディングＲＮＡであってもよい。好ましくは，上記免疫活性化ＲＮＡは，一本鎖ＲＮＡ，二本鎖ＲＮＡ，または部分的二本鎖ＲＮＡであり，さらに好ましくは，一本鎖ＲＮＡ，および／または環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡ，さらに好ましくは直鎖ＲＮＡである。さらに好ましくは，上記免疫活性化ＲＮＡは，（直鎖）一本鎖ＲＮＡである。一層好ましくは，上記免疫活性化ＲＮＡは，（（直鎖）一本鎖）メッセンジャーＲＮＡ（ｍ ＲＮＡ，さらに好ましくは直鎖ＲＮＡである。さらに好ましくは，上記免疫活性化ＲＮＡは，（直鎖）一本鎖ＲＮＡである。一層好ましくは，上記免疫活性化ＲＮＡは，（（直鎖）一本鎖）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。免疫活性化ＲＮＡは，さらに，上記において定義された低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても生じる。 【００９３】ここで使用される免疫活性化ＲＮＡは，さらに，天然にみられるか，または合成によって調整され，かつ免疫応答を誘引する任意のクラスのＲＮＡ分子から選択されてもよい。この文脈において，免疫応答は様々な仕組みで現れる。適切な免疫応答にとって大きな要素は，異なるＴ細胞小グループの活性化である。Ｔリンパ球は通常，ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞とヘルパーＴ２（Ｔｈ２）細胞の２つの小グループに分類され，免疫系はこの２つの小グループを使って，細胞内（Ｔｈ１）病原体（例えば抗原）および細胞外（Ｔｈ２）病原体（例えば抗原）を破壊できる。上記２つのＴｈ細胞グループは，それぞれが生成するエフェクタータンパク質（サイトカイン）のパターンにおいて異なる。したがって，Ｔｈ１細胞は，マクロ- 40 -ファージと細胞傷害性Ｔ細胞の賦活によって細胞性免疫応答を補助する。 一方，Ｔｈ２細胞は，Ｂ細胞を活性化して血漿細胞に転換すること，および（例えば抗原に対抗する）抗体を形成することによって，体液性免疫応答を促進する。したがって，免疫応答においてＴｈ１／Ｔｈ２比は非常に重要である。本発明の関連においては，免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２比は，好ましくは細胞性応答（Ｔｈ１応答）側に向かってシフトしていて，その結果，細胞性免疫応答が誘引される。一例としては，免疫系はトール様受容体（ＴＬＲ）のリガンドによって賦活される。ＴＬＲとは，病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇ 答）側に向かってシフトしていて，その結果，細胞性免疫応答が誘引される。一例としては，免疫系はトール様受容体（ＴＬＲ）のリガンドによって賦活される。ＴＬＲとは，病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎ；ＰＡＭＰ）を認識する，高度に保存的なパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＲＲ）ポリペプチドのファミリーである。ＴＬＲは，さらに，哺乳類の先天的免疫において重要な役割を果たす。現在少なくとも１３のファミリーメンバーが確認され，それぞれＴＬＲ１～ＴＬＲ１３（トール様受容体：ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，ＴＬＲ５，ＴＬＲ６，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，ＴＬＲ９，ＴＬＲ１０，ＴＬＲ１１，ＴＬＲ１２，およびＴＬＲ１３）と称されている。さらに，複数の特異的ＴＬＲリガンドが確認されている。例えば，非メチル化細菌性ＤＮＡおよびその合成類似体（ＣｐＧＤＮＡ）はＴＬＲ９のリガンドであることが見出されている…。さらに，あるＴＬＲに対するリガンドが，ある核酸分子を含んでいること，およびあるタイプのＲＮＡが，配列から独立してまたは配列に対して依存的に免疫活性を有していて，これらの各種免疫活性化ＲＮＡが例えばＴＬＲ３，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，または細胞内受容体（例えばＲＩＧ－Ｉ，ＭＤＡ－５など）を活性化することも報告されている…。Ｌｉｐｆｏｒｄｅｔａｌ．に記載の免疫活性Ｇ，Ｕ含有オリゴリボヌクレオチドは，リボゾームＲＮＡ，トランスファーＲＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ，- 41 -およびウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ由来のものであると考えられる。 【００９４】本発明によれば，例えば，実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ - 41 -およびウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ由来のものであると考えられる。 【００９４】本発明によれば，例えば，実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（式Ｉ）によって表わされるキャリアペプチドで複合化された，上記において定義された任意のＲＮＡ（分子）は，（具体的な長さ，一本鎖もしくは二本鎖の状態，修飾，および／またはヌクレオチド配列には無関係に）免疫活性を有する，つまり免疫応答を亢進することが見出された。それゆえ，実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（式Ｉ）によって表わされるキャリアペプチドで複合化され，上記において定義されたＲＮＡは，特定の治療に対して適しており，かつ，そうすることが望ましいのであれば，（非特異的）免疫活性化を亢進するために使用できる。したがって，式（Ｉ）によって表わされるペプチドで任意のＲＮＡを複合化することで免疫活性化効果を奏することは，本発明の複合化ＲＮＡが内在する特性であると言える。 【００９５】本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つの（免疫活性）ＲＮＡ（分子）は，それゆえ，ＴＬＲのリガンドを表わすおよび／またはＴＬＲのリガンドをコードするＲＮＡ配列（ただしこれに限定されるものではない）を含む，免疫活性を有することが知られている任意のＲＮＡ配列を含んでいる。 なお，前記ＴＬＲのリガンドは，好ましくはＴＬＲ１～ＴＬＲ１３からなるファミリーから選択され，さらに好ましくはＴＬＲ７およびＴＬＲ８，つまりＲＮＡ（例えばＲＩＧ－ＩまたはＭＡＤ－５など）またはその他の任意の免疫活性化ＲＮＡ配列の細胞内受容体のリガンドから選択される…。さらに，免疫活性化ＲＮＡとして使用されるＲＮＡ分子（のクラス）は，免疫応答を誘発可能なその他の任意のＲ －５など）またはその他の任意の免疫活性化ＲＮＡ配列の細胞内受容体のリガンドから選択される…。さらに，免疫活性化ＲＮＡとして使用されるＲＮＡ分子（のクラス）は，免疫応答を誘発可能なその他の任意のＲＮＡを含んでいてもよい。こ- 42 -のような免疫活性化ＲＮＡとしては，リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ），メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），およびウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）などがあげられるが，これに限定されるものではない。 【００９８】好ましくは，本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）としてここで使用される免疫活性化ＲＮＡ分子は，一般的に本発明の複合化ＲＮＡのＲＮＡ分子について上記において定義された長さを有し，さらに好ましくは５～５０００，５００～５０００，さらに好ましくは１０００～５０００，あるいは５～１０００，５～５００，５～２５０，５～１００，５～５０，さらに好ましくは５～３０ヌクレオチドの長さを有する。 ク 【０１３９】本発明に係わるＲＮＡ複合体の成分の質量比またはモル比とは，１つ以上のオリゴペプチドに対するＲＮＡ（一本鎖でも二本鎖でもよい）の質量比またはモル比の意味であり，通常，いかなる制限を受けるものではなく，特定の適用に対して適切なものが選ばれる。ただし，上記１つ以上のオリゴペプチドとＲＮＡとの質量比またはモル比は，１：１未満，１：２未満，１：３未満，１：４未満，１：５未満，１：６未満，１：７未満，１：８未満，１：９未満，１：１０未満，１：１１未満，１：１２未満，１：１３未満，１：１４未満，１：１５未満，１：１６未満，１：１７未満，１：１８未満，または１：２０未満であってもよい。あるいは，上記１つ以上のオリゴペプチドとＲＮＡとの質量比またはモル比は，１：１，２：１ 未満，１：１４未満，１：１５未満，１：１６未満，１：１７未満，１：１８未満，または１：２０未満であってもよい。あるいは，上記１つ以上のオリゴペプチドとＲＮＡとの質量比またはモル比は，１：１，２：１，３：１，４：１，５：１，６：１，７：１，８：１，９：１，１０：１，１１：１，１２：１，１３：１，１４：１，１５：１，１６：１，１７：１，１８：１，１９：１，または２０：１を超えてもよい。好ましくは，上記１つ以上のオリゴペプチドとＲＮＡとの質量比またはモル比は，上記- 43 -１つ以上のオリゴペプチドの含有量に対して１：５以上でもよい。さらに好ましくは，上記１つ以上のオリゴペプチドとＲＮＡとの（モル比または）質量比は１：５～２０：１，さらに好ましくは１：３～１５：１である。 【０１４０】特定の好適な実施形態によれば，本発明に係るＲＮＡ複合体の成分の質量比，特に，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）の質量比は，好ましくは約１：１００～約１：０．５の範囲であり，さらに好ましくは約１：５０～約１：１の値を有し，一層好ましくは，複合体におけるＲＮＡ：ペプチドの比に関して約１：１００，約１：９０，約１：８０，約１：７０，約１：６０，約１：５０，約１：４５，約１：４０，約１：３５，約１：３０，約１：２５，約１：２０，約１：１５，約１：１０，約１：５，約１：４，約１：３，約１：２，または約１：１，さらに約１：０．５に達する値を有する。なお，上記の具体的に示した値を２つ組み合わせることによって，任意の範囲を形成してもよい。最も好ましくは，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）の質量比は，約１：５０～約１：１の範囲であってもよい。 【０１４１】同様に，本発明 してもよい。最も好ましくは，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）の質量比は，約１：５０～約１：１の範囲であってもよい。 【０１４１】同様に，本発明に係るＲＮＡ複合体の成分のモル比，特に，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）のモル比は，好ましくは，特定の好適な実施形態によれば，約１：２００００～約１：５００の範囲であり，さらに１：２５０に達する値でもよく，さらに好ましくは約１：１００００～約１：１０００の範囲，一層好ましくは，複合体におけるＲＮＡ：ペプチドの比に関して約１：９５００，約１：９０００，約１：８５００，約１：８０００，約１：７５００，約１：７０００，約１：６５００，約１：６０００，約１：５５００，約- 44 -１：５０００，約１：４５００，約１：４０００，約１：３５００，約１：３０００，約１：２５００，約１：２０００，約１：１５００，約１：１０００，約１：５００，約１：４５０，約１：４００，約１：３５０，約１：３００，または約１：２５０の値を有する。なお，上記の具体的に示した値を２つ組み合わせることによって，任意の範囲を形成してもよい。 最も好ましくは，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）のモル比は，約１：１００００～約１：１０００の範囲である。免疫活性化のためには，本発明に係わるＲＮＡ複合体の成分のモル比は，約１：１００００～約１：１００の範囲であってもよく，さらに，約１：１００００～約１：５００に達する範囲であってもよい。 【０１４２】本発明の文脈において，上記モル比および質量比は，通常互いに関連しており，各比は，例えばＲＮＡの長さやペプチドの長さなどの要素によって影響を受 ５００に達する範囲であってもよい。 【０１４２】本発明の文脈において，上記モル比および質量比は，通常互いに関連しており，各比は，例えばＲＮＡの長さやペプチドの長さなどの要素によって影響を受けることがある。ただし，判定の際には質量比およびモル比を平均複合体サイズに対して算出してもよく，約１：５０～１：１の質量比が約１：１００００～１：１０００のモル比にほぼ対応する。モル比および質量比の代表的な例は，実施例において示す。この代表的な値はさらに計算の際に使用してもかまわない。 【０１４３】さらに，本発明に係るＲＮＡ複合体の成分の比，特に，上記１つ以上のオリゴペプチドに対する複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）の比は，さらに，全てのＲＮＡ複合体の窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）に基づいて算出されてもよい。例えば，１μｇのＲＮＡは，ＲＮＡが塩基の統計的分布を示すと仮定すれば，通常約３ｎｍｏｌのリン酸塩残基を含有している。また，１μｇのペプチドは，分子量および塩基性アミノ酸の個- 45 -数に依存して，通常約ｘｎｍｏｌの窒素残基を含有している。好適な一例として，（Ａｒｇ）９（分子量１４２４ｇ／ｍｏｌ，窒素原子９個）の場合について算出すると，１μｇの（Ａｒｇ）９が約７００ｐｍｏｌの（Ａｒｇ）９を含有し，それゆえ，７００ｘ９＝６３００ｐｍｏｌの塩基性アミノ酸，つまり６．３ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。質量比ＲＮＡ／（Ａｒｇ）９が約１：１の場合，Ｎ／Ｐ比の計算結果は約２になる。好適な一例として，質量比が約２：１であり，２μｇのＲＮＡを含むプロタミン（分子量約４２５０ｇ／ｍｏｌ，サケのプロタミンを使用した場合，窒素原子は２１個）の場合について算出すると，このＲＮＡについては，リン酸塩が６ｎｍｏｌであることが計算の結果得られる。１ むプロタミン（分子量約４２５０ｇ／ｍｏｌ，サケのプロタミンを使用した場合，窒素原子は２１個）の場合について算出すると，このＲＮＡについては，リン酸塩が６ｎｍｏｌであることが計算の結果得られる。１μｇのプロタミンは約２３５ｐｍｏｌのプロタミン分子を含有し，それゆえ，２３５ｘ２１＝４９３５ｐｍｏｌの塩基性窒素原子，つまり４．９ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約２：１の場合，Ｎ／Ｐ比の計算結果は約０．８１になる。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約８：１の場合，Ｎ／Ｐ比の計算結果は約０．２になる。本発明の文脈において，Ｎ／Ｐ比は，好ましくは約０．２～５０，好ましくは約０．５～５０，最も好ましくは約０．７５～２５，または１～２５の範囲である（複合体中のＲＮＡ：ペプチド比について，一層好ましくは，約１０～５０の範囲，最も好ましくは約２５～５０の範囲である）。 【０１４４】本発明の別の一実施形態は，本発明に係る複合化ＲＮＡ，ならびに必要に応じて（薬学的に）適切なキャリアおよび／または別の補助的物質および添加剤を備えた組成物，好ましくは薬学的組成物に関する。…ケ 【０１７４】特に好適な実施形態によれば，血液細胞および／または造血細胞，またはその部分的な集団，つまり，血液（全血）から単離される任意のタイプ- 46 -の細胞および／またはこれらの細胞に由来する培養株化細胞に由来する任意のタイプの細胞に，本発明において定義される複合化ＲＮＡが上記トランスフェクション法を使ってトランスフェクトされてもよい。…本発明において定義されるｍＲＮＡによってコードされたある抗原に対して治療を受ける患者に接種する場合には，個々人，特に治療を受ける実際の患者の例えば血液から得られる血液細胞（例えばＰＢＭＣ）を，手間と時間と費 いて定義されるｍＲＮＡによってコードされたある抗原に対して治療を受ける患者に接種する場合には，個々人，特に治療を受ける実際の患者の例えば血液から得られる血液細胞（例えばＰＢＭＣ）を，手間と時間と費用のかかる細胞培養手法を使って，プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）（特に樹状細胞（ＤＣ））を高い比率で含んだ細胞の集団に分化させることが不要なのである。翻って，血液細胞，特に上述した血液細胞の部分的な集団を採取する例えば実際の患者において，適切な免疫活性化を実現する薬学的組成物を得るために，１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡを直接血液細胞にトランスフェクトすれば，免疫活性化を成功させるには充分なのである。なお，この免疫活性化は，好ましくは腫瘍からの１つ以上の抗原，もしくは病原菌または薬剤からの１つ以上の抗原に対して向けられる。本発明において定義される複合化ＲＮＡを血液細胞または血液細胞に由来する（血液細胞から単離，または各培養株化細胞から単離される）細胞にトランスフェクトすることは，抗原に限定されるものではなく，当然，複合化ＲＮＡを得るために使用される，本発明において定義される任意のＲＮＡ，例えば本発明において定義される任意の他の免疫活性化ＲＮＡや任意のコーディングＲＮＡなどに関連する。 【０１７６】また，ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで使用されてもよいトランスフェクション法は，例えば本発明において言及される各種疾病の治療法としてｉｎｖｉｖｏで使用しても非常に適切である。…特定の疾病の治療および／または予防は，通常，本発明の複合化ＲＮＡのＲＮＡによってコードされた適切なタンパク質の選択に左右される。…- 47 -【０１７７】…疾病または病状の例としては，例えば以下に列挙する疾病から選択される癌または腫瘍疾患 合化ＲＮＡのＲＮＡによってコードされた適切なタンパク質の選択に左右される。…- 47 -【０１７７】…疾病または病状の例としては，例えば以下に列挙する疾病から選択される癌または腫瘍疾患があげられるが，これに限定されるものではない。 …【０１７８】この文脈において，疾病または病状のさらに別の例としては，例えば以下に列挙する疾病から選択されるウイルス性感染症から選択される感染症などがあげられるが，これに限定されるものではない。…コ 【０１９２】一実施形態によれば，本発明は，上記において定義された組織または生体において免疫反応を調節する，好ましくは誘引または亢進するために（薬剤を調製するために），さらに好ましくは本発明において言及される疾病または状態を支援するために，本発明に係わる少なくとも１つの複合化ＲＮＡを使用することをさらに含む。こうすることによって，本発明の複合化ＲＮＡは，免疫系を非特異的に賦活化するために，例えばあるサイトカインの生成を誘発するために使用されてもよい。したがって上記複合化ＲＮＡは，例えば病原体または腫瘍に由来する抗原によって誘発される特異的免疫反応を支援するために使用されてもよい。この文脈において薬剤は，例えば上記において定義された薬学的組成物であっても，または本発明において定義され，本発明の複合化ＲＮＡ，ワクチンなどを含んだ注射用緩衝液であってもよい。上記免疫反応は，８～１５アミノ酸の長さを有し，かつ実験式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドに起因する少なくとも１つの複合化ＲＮＡによって調節されてもよく，および／または上記複合化ＲＮＡのＲＮＡによってコードされたタンパク質の免疫活性特性によって調節されてもよ る１つ以上のオリゴペプチドに起因する少なくとも１つの複合化ＲＮＡによって調節されてもよく，および／または上記複合化ＲＮＡのＲＮＡによってコードされたタンパク質の免疫活性特性によって調節されてもよい。 - 48 -【０１９３】したがって，本発明は，必要に応じて，様々な目的を実現するのに非常に役立つ。複合化ＲＮＡは，そのままでまたは本発明の組成物の成分として，それ自体が，本発明の複合体の成分としてのＲＮＡのトランスフェクション性を改善する。本発明の複合化ＲＮＡのこの根底にある性質は，様々な応用にとって有益である。細胞にＲＮＡを導入したい時には，本発明によって，トランスフェクション効率の改善が必ず保証される。この特性そのものが，多種多様な疾病の治療，上記において定義された例えば単遺伝子疾患または遺伝子疾患を治療するための本発明の使用を可能にする。 【０１９４】さらに，本発明は，免疫障害，例えばアレルギー性疾患または自己免疫疾患の治療が予想される場合はいつでも使用されてもよい。また，本発明は，患者の免疫系の非特異的または特異的免疫反応を亢進することによって，該免疫系を賦活化せてもよい。したがって，本発明は，適切な場合は，疾病を治療するために非特異的免疫反応を誘発してもよい。また，必要に応じて，（例えば本発明の複合体の成分としてのＲＮＡによって抗原をコードすることによって）特異的免疫反応をそのまま誘発してもよく，または本発明の複合化ＲＮＡと抗原とを例えば同一組成物として組み合わせることによって誘発してもよい。…サ 【０１９９】図面以下の図は，本発明をさらに説明するためのものであり，図面に示した範囲に本発明の主題を限定するものではない。 【０２０６】図７は，ｈＰＢＭＣにおいてノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）また 図面以下の図は，本発明をさらに説明するためのものであり，図面に示した範囲に本発明の主題を限定するものではない。 【０２０６】図７は，ｈＰＢＭＣにおいてノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはポリ－Ｌ－アルギニンで複合化されたＲＮＡのそれぞれの免疫活性効果を，- 49 -比較例において比較した結果を示す。有利な効果として，１：５（ＲＮＡ：ノナアルギニン）未満の質量比の場合（１：１０，１：８，１：５，１：２，１：１，２：１）に，非常に高い免疫活性効果が観察される。ただし，ＲＮＡ：ノナアルギニン質量比が５：１の場合には，観察されるＴＮＦα生成量はあまり多くない。ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはｍＲＮＡを単独で使用した活性化実験についても，同じことが言える。また，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）と比較すると，ｍＲＮＡをポリ－Ｌ－アルギニンで複合化することによって，ＴＮＦα生成の誘引が大幅に減少することが観察された。ポリ－Ｌ－アルギニンの濃度が高いと，そのポリ－Ｌ－アルギニンがトランスフェクトされる細胞にとって有害であるようである。ポリ－Ｌ－アルギニン：ＲＮＡの質量比が１：２以上の場合，細胞が溶解するので特に有害なようである。 【０２０７】図８は，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）を使ったＲＮＡの複合体を，ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすると発現するルシフェラーゼを示す。 図８から読み取れるように，２：１（ＲＮＡ：ノナアルギニン）未満の質量比が有利なようである。対照的に，（高分子）ポリ－Ｌ－アルギニンで複合化しても，低いルシフェラーゼ活性しか生じない。したがって，（高分子）ポリ－Ｌ－アルギニンは，ｍＲＮＡのトランスフェクションには適していないようである。 【０２０９】図１０は，ｈＰＢＭＣ細胞におけるヘプタアルギニン（（Ａｒ 性しか生じない。したがって，（高分子）ポリ－Ｌ－アルギニンは，ｍＲＮＡのトランスフェクションには適していないようである。 【０２０９】図１０は，ｈＰＢＭＣ細胞におけるヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化されたＲＮＡの免疫活性効果を，ＩＬ－６生成量を測定することによって示している。図から読み取れるように，ｈＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６生成量は非常に大きい。つまり，ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化されたＲＮＡの免疫活性効果は非常に高い。 - 50 -【０２２０】図２１は，ｈＰＢＭＣにおけるＴＮＦαの分泌に対する，Ｒ９Ｈ３で複合化されたＲＮＡの免疫活性効果を示す。 【０２２１】図２２は，ｈＰＢＭＣにおけるＩＬ－６の分泌に対する，Ｒ９Ｈ３で複合化されたＲＮＡの免疫活性効果を示す。 シ 【０２４０】（実施例４：ＨｅＬａ細胞における，配列番号３５または配列番号３６によって表わされる安定化されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ－ＲＮＡｃｔｉｖｅ）の，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）によって媒介されるトランスフェクションおよび発現）トランスフェクションの１日前に，ＨｅＬａ細胞（１５０×１０３／穴）を２４穴のマイクロタイターのプレートに播種し，トランスフェクション実施時に７０％コンフルエントの状態にした。トランスフェクションをするために，実施例３に開示した上記ＲＮＡ／（ペプチド）溶液（４０μｌ）５０μｌを，血清を含まない培地２５０μｌと混合し，上記細胞（最終ＲＮＡ濃度：１３μｇ／ｍｌ）に添加した。トランスフェクション溶液の添加に先立って，上記ＨｅＬａ細胞を，一穴について１ｍｌのオプティメン（Ｏｐｔｉｍｅｎ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で穏やかかつ慎重に２度洗浄した。そして，上記トランスフェクション溶液（３００μｌ／穴） 加に先立って，上記ＨｅＬａ細胞を，一穴について１ｍｌのオプティメン（Ｏｐｔｉｍｅｎ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で穏やかかつ慎重に２度洗浄した。そして，上記トランスフェクション溶液（３００μｌ／穴）を上記細胞に添加し，細胞を３７℃で４時間培養した。その後，１０％ＦＣＳを含んだ３００μｌのＲＰＭＩ培地（Ｃａｍｐｒｅｘ）を各穴に添加し，上記細胞を３７℃でさらに２０時間培養した。上記トランスフェクション溶液を，トランスフェクションの２４時間後に吸引によって排出し，上記細胞を３００μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＰＯ４，２ｍＭのＥＤＴＡ，１０％のグリセロール，１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，２ｍ- 51 -ＭのＤＴＴ）に溶解させた。そして，その上清をルシフェリン緩衝液（２５ｍＭのグリシルグリシン，１５ｍＭのＭｇＳＯ４，５ｍＭのＡＴＰ，６２．５μＭのルシフェリン）と混合し，ルミノメーター（ＬｕｍａｔＬＢ ９５０７（ＢｅｒｔｈｏｌｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ドイツ，ＢａｄＷｉｌｄｂａｄ））を使って蛍光を検出した。これらの実験の結果を図８および図１２～図１８に示す。 【０２４１】（実施例５：ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはポリ－Ｌ－アルギニン（比較例）を用いたＲＮＡ複合体の，トランスフェクション時の免疫活性化）ａ）トランスフェクション実験健康なドナーの末梢血から得られたＨＰＢＭＣ細胞を，フィコール勾配を使って単離し，その後１ｘＰＢＳ（リン酸塩を緩衝液とする生理食塩水）で洗浄した。そして上記細胞を９６穴のマイクロタイタープレート（２００×１０３／穴）に播種した。上記ｈＰＢＭＣ細胞を，実施例４に記載の手順で，１０μｌの上記ＲＮＡ／ペプチド複合体（ＲＮＡ最終濃度：６μｇ／ｍｌ，同量のＲＮＡを使用）とともに，Ｘ－ＶＩＶＯ ト（２００×１０３／穴）に播種した。上記ｈＰＢＭＣ細胞を，実施例４に記載の手順で，１０μｌの上記ＲＮＡ／ペプチド複合体（ＲＮＡ最終濃度：６μｇ／ｍｌ，同量のＲＮＡを使用）とともに，Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）（最終ＲＮＡ濃度：１０μｇ／ｍｌ）において２４時間培養した。ｈＰＢＭＣ細胞に対する免疫活性効果を，サイトカインの生成（インターロイキン６と腫瘍壊死因子α）を検出することによって測定した。したがって，ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｂ）を，特異的なサイトカイン抗体をさらに含んだ結合緩衝液（０．０２％のＮａＮ３，１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３，１５ｍＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．７）とともに一晩（ｏ／ｎ）培養した。そして１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んだ１ｘＰＢＳで細胞を封止した。 上記細胞の上清を添加し，３７℃で４時間培養した。その後，上記マイク- 52 -ロタイタープレートを１ｘＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０で洗浄し，ビオチンで標識した二次抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ドイツ，ハイデルブルグ）と共に培養した。ストレプトアビジン結合した西洋わさびペルオキシダーゼを上記プレートに添加した。そして，そのプレートを，０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含んだ１ｘＰＢＳで再度洗浄し，ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチル－ベンズチアゾリン－６－スルホン酸）を基質として添加した。サイトカインの量は，ＳｕｎｒｉｓｅＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ，ドイツ，クライルスハイム）を用いて組み換えサイトカイン（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ドイツ，ハイデルブルグ）と共に標準曲線を使用し，４０５ｎｍ（ＯＤ４０５）における吸収度を測定することによって決定した。 【０２４２】ｂ）結果 換えサイトカイン（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ドイツ，ハイデルブルグ）と共に標準曲線を使用し，４０５ｎｍ（ＯＤ４０５）における吸収度を測定することによって決定した。 【０２４２】ｂ）結果ｉ）ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）で複合化したＲＮＡの免疫活性効果ｉ１）ＨＰＢＭＣ細胞を，上記において開示したように，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）で複合化したＲＮＡとともに２４時間培養した。ここで，ＲＮＡ：（Ａｒｇ）９の質量比は１：１であった。次に，上記細胞上清内におけるＩＬ－６の生成量をＥＬＩＳＡを使って測定した。その結果，ＨＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６生成量は非常に大きかった。つまり，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）（図５を参照）で複合化したＲＮＡの免疫活性効果は非常に高かった。 【０２４３】ｉ２）ＨＰＢＭＣ細胞を，上記において開示したように，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）で複合化したＲＮＡとともに２４時間培養した。ここで，ＲＮＡ：（Ａｒｇ）９の質量比は１：１であった。次に，上記上清- 53 -細胞内におけるＴＨＦαの生成量をＥＬＩＳＡを使って測定した。その結果，ＨＰＢＭＣ細胞のＴＮＦα生成量は非常に大きかった。つまり，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）（図６を参照）で複合化したＲＮＡの免疫活性効果は非常に高かった。 【０２４４】ｉｉ）ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはポリ－Ｌ－アルギニンで複合化したＲＮＡそれぞれの免疫活性効果の比較結果（比較例）ｈＰＢＭＣを，ＲＮＡの複合体およびノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはポリ－Ｌ－アルギニンなどを用いて，異なるＲＮＡ：ノナアルギニンの質量比（１：１０，１：８，１：５，１：２，１：１，２：１，５：１，８：１および１０：１）の条件でそれぞれ２４時間培養した。その後，ＴＮＦ Ｌ－アルギニンなどを用いて，異なるＲＮＡ：ノナアルギニンの質量比（１：１０，１：８，１：５，１：２，１：１，２：１，５：１，８：１および１０：１）の条件でそれぞれ２４時間培養した。その後，ＴＮＦαの生成量をＥＬＩＳＡを使って測定した。 【０２４５】有利な効果として，５：１（ＲＮＡ：ノナアルギニン）未満の質量比の場合（１：１０，１：８，１：５，１：２，１：１，２：１）（図７を参照）に，非常に高い免疫活性効果が観察された。ＲＮＡ：ノナアルギニン質量比が５：１の場合には，観察されるＴＮＦα生成量はあまり多くない。 ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはｍＲＮＡを（図７の左側を参照）単独で使用した活性化実験についても，同じことが言える。 【０２４６】また，ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）（図７の右側を参照）と比較すると，ポリ－Ｌ－アルギニンによってｍＲＮＡを複合化することによって，ＴＮＦαの生成の誘引が大幅に減少する。さらに，観察によると，ポリ－Ｌ－アルギニンの濃度が高いと，ポリ－Ｌ－アルギニンがトランスフェクトされる細胞にとって有害であるようである。ＲＮＡ：ポリ－Ｌ－アルギニンの質量比が１：２以下の場合，細胞が溶解するので特に有害なようで- 54 -ある。 【０２４７】（実施例６：ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）またはポリ－Ｌ－アルギニンを用いたＲＮＡ複合体をトランスフェクトする際における，ＨｅＬａ細胞におけるそれぞれのルシフェラーゼの発現（比較例））ａ）ノナアルギニン（（Ａｒｇ）９）を用いたＲＮＡ複合体をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトする際における，ルシフェラーゼの発現。異なる比率のノナアルギニンまたはポリ－Ｌ－アルギニンでそれぞれ複合化したルシフェラーゼをコードするＲＮＡｃｔｉｖｅを，ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした クトする際における，ルシフェラーゼの発現。異なる比率のノナアルギニンまたはポリ－Ｌ－アルギニンでそれぞれ複合化したルシフェラーゼをコードするＲＮＡｃｔｉｖｅを，ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＮＡ：ノナアルギニンの質量比は，２：１未満が有利なようである（図８を参照）。 【０２４８】ｂ）比較すると，（高分子）ポリ－Ｌ－アルギニンで複合化しても，ルシフェラーゼ活性が高いレベルにまで増加することはないようである。したがって，（高分子）ポリ－Ｌ－アルギニンは，ｍＲＮＡ（図８参照）のトランスフェクションには適していないようである。 【０２５０】（実施例８：ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）を用いたＲＮＡ複合体をトランスフェクトする際における免疫活性化（比較例））ａ）トランスフェクション実験ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）について，上述の実施例５の実験と同様にトランスフェクション実験を実施した。 【０２５１】ｂ）ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化したＲＮＡの免疫活性効果の結果ｉ）ＨＰＢＭＣ細胞を，上記において開示したように，ヘプタアルギニ- 55 -ン（（Ａｒｇ）７）で複合化したＲＮＡとともに２４時間培養した。ここで，ＲＮＡ：（Ａｒｇ）７の質量比は１：１であった。次に，細胞上清内におけるＩＬ－６の生成量を，ＥＬＩＳＡを使って測定した。その結果，ＨＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６生成量は非常に大きかった。つまり，ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化されたＲＮＡの免疫活性効果は非常に高かった（図１０参照）。 【０２５２】ｉｉ）ＨＰＢＭＣ細胞を，上記において開示したように，ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化したＲＮＡとともに２４時間培養した。ここで，ＲＮＡ：（Ａｒｇ 高かった（図１０参照）。 【０２５２】ｉｉ）ＨＰＢＭＣ細胞を，上記において開示したように，ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化したＲＮＡとともに２４時間培養した。ここで，ＲＮＡ：（Ａｒｇ）７の質量比は１：１であった。次に，細胞上清内におけるＴＨＦαの生成量をＥＬＩＳＡを使って測定した。その結果，ＨＰＢＭＣ細胞のＴＮＦα生成量は非常に大きかった。つまり，ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７）で複合化したＲＮＡの免疫活性効果は非常に高かった（図１１参照）。 【０２５６】（実施例１１：ｈＰＢＭＣにおけるＲ９Ｈ３を用いた免疫活性化）ｈＰＢＭＣにおける免疫活性化に対するＲ９Ｈ３の効果を試験した。したがって，上述の実施例３のＲ９Ｈ３とＲＮＡとの複合体を調製した。さらに，健康なドナーの末梢血から得られたＨＰＢＭＣ細胞を，フィコール勾配を使って単離し，その後１×ＰＢＳ（リン酸塩を緩衝液とする生理食塩水）で洗浄した。そして上記細胞を９６穴のマイクロタイタープレート（２００×１０３／穴）に播種した。上記ｈＰＢＭＣ細胞を，実施例４に記載の手順で，１０μｌの上記ＲＮＡ／ペプチド複合体（最終ＲＮＡ濃度：６μｇ／ｍｌ，同量のＲＮＡを使用）とともに，Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）において２４時間培養した。ｈＰＢＭＣ細胞に対する免疫活性効果を，サイトカインの生成（インターロイキン６- 56 -と腫瘍壊死因子α）を検出することによって測定した。したがって，ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｂ）を，特異的なサイトカイン抗体をさらに含んだ結合緩衝液（０．０２％のＮａＮ３，１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３，１５ｍＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．７）とともに一晩（ｏ／ｎ）培養した。そして１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んだ イン抗体をさらに含んだ結合緩衝液（０．０２％のＮａＮ３，１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３，１５ｍＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．７）とともに一晩（ｏ／ｎ）培養した。そして１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んだ１×ＰＢＳで細胞を封止した。上記細胞の上清を添加し，３７℃で４時間培養した。その後，上記マイクロタイタープレートを１×ＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０で洗浄し，ビオチンで標識した二次抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ドイツ，ハイデルブルグ）と共に培養した。ストレプトアビジン結合した西洋わさびペルオキシダーゼを上記プレートに添加した。そして，そのプレートを，０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含んだ１×ＰＢＳで再度洗浄し，ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチル－ベンズチアゾリン－６－スルホン酸）を基質として添加した。サイトカインの量は，ＳｕｎｒｉｓｅＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ，クライルスハイム，ドイツ）を用いて組み換えサイトカイン（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ドイツ，ハイデルブルグ）と共に標準曲線を使用し，４０５ｎｍ（ＯＤ４０５）における吸収度を測定することによって決定した。結果は図２１および図２２に示す。図から読み取れるように，ＲＮＡ：Ｒ９Ｈ３の比が１：５０００のときに，免疫活性化が非常に高かった。 (2) 前記(1)によれば，本願明細書には，本願補正発明に関し，次の点が開示されていることが認められる。 ア本願補正発明は，８～１５アミノ酸の長さであり，かつ式（Ａｌｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘによって表わされる一つ以上のオリゴペプチドと複合体を形成するＲＮＡ（分子）を少なくとも１つ含む，免疫反応を誘引又は亢進するための複合化ＲＮＡに関する（【請- 57 -求項１】，段落【０００１】 よって表わされる一つ以上のオリゴペプチドと複合体を形成するＲＮＡ（分子）を少なくとも１つ含む，免疫反応を誘引又は亢進するための複合化ＲＮＡに関する（【請- 57 -求項１】，段落【０００１】）。 イ細胞又は組織に核酸をトランスフェクト（導入）することは，分子医学の主要な方法であって，多数の疾病の治療及び予防において重要な役割を果たしている（段落【０００２】）。核酸をトランスフェクトする方法として，例えば，細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を用いる方法が周知である。 ＣＰＰは，通常，塩基性アミノ酸が多い７～３０個のアミノ酸からなる低分子ぺプチドであって，ＤＮＡ等のマクロ分子と共有結合により複合体を形成する。ＣＰＰがポリアルギニンの場合，ＣＰＰによって複合化されたマクロ分子は，負に帯電した細胞表面のグリコサミノグリカンに結合し，エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが提案されている（段落【０００８】）。 ＲＮＡは，ＤＮＡと異なり宿主ゲノムに組み込まれる危険性がないためＤＮＡに比べて有利であるが（段落【００２０】），ＣＰＰを使った細胞内部へのＲＮＡの輸送は，ＲＮＡの劣化が速いこと，及び複合体の安定性が低いことから，特に低分子ＲＮＡ，例えば二本鎖ｓｉＲＮＡに限定され，非常に限られた事例数しか報告されていない（段落【００１７】，【００１９】）。 ウそこで，本願補正発明は，細胞内へのＲＮＡ輸送に適した，効率的なキャリアを提供し，腫瘍，循環器病や感染症などの特定の疾病の治療用複合化ＲＮＡを提供することを目的（課題）とし（【請求項１】，段落【００２１】），その目的を達成する手段（課題を解決する手段）として，８～１５アミノ酸の長さであり，かつ式（Ａｌｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以 ，段落【００２１】），その目的を達成する手段（課題を解決する手段）として，８～１５アミノ酸の長さであり，かつ式（Ａｌｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドと，少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ（分子）とが，非共有的な相互作用によって連結した免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡであって，ＲＮＡ（分子）のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）が，０．５～５０の- 58 -範囲であり，かつ，ＲＮＡ（分子）対オリゴペプチドのモル比（以下，単に「モル比」ということがある。）が１：２５０以上である複合化ＲＮＡを採用したものである（【請求項１】）。 エ本願補正発明に係る複合化ＲＮＡは，正電荷を帯びたオリゴペプチドと，負電荷を帯びたＲＮＡとの間の非共有的な相互作用により可逆的に連結したものであり，細胞内においては，ＲＮＡとオリゴペプチドとが解離した状態で平衡であるように思われる（段落【００２３】）。 本願補正発明のＲＮＡは，一本鎖ＲＮＡであれば，任意のＲＮＡであってよく，長さも任意である。例えば，①低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチド，②コーディングＲＮＡ，③免疫活性化ＲＮＡなどを使用できる（段落【００４８】）。 ①低分子ＲＮＡは，５～１００ヌクレオチドの長さであり，例えば，（非特異的）免疫活性化のために使用される（段落【００４９】，【００５０】）。②コーディングＲＮＡは，タンパク質をコードするｍＲＮＡであり，細胞内でタンパク質に翻訳されるものである。コードされるタンパク質として，アジュバントタンパク質（ＴＮＦαやＩＬ－６などサイトカイン）などの生来の免疫反応（例えば，外因性リガンドがＴＬＲに結合する反応）を誘発するもの，ウイルスや腫瘍に由来する抗原などの抗原特異的免疫応答 ジュバントタンパク質（ＴＮＦαやＩＬ－６などサイトカイン）などの生来の免疫反応（例えば，外因性リガンドがＴＬＲに結合する反応）を誘発するもの，ウイルスや腫瘍に由来する抗原などの抗原特異的免疫応答を誘発するものがある（段落【００５１】，【００５２】，【００５７】～【００６１】，【００７０】，【００７３】）。③免疫活性化ＲＮＡは，オリゴペプチドでＲＮＡを複合化する以前に，既に免疫活性化効果を示すが，複合化することによってその免疫活性効果が亢進又は誘引される。 免疫活性化ＲＮＡは，好ましくは，ｍＲＮＡや低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。また，ＴＬＲ７やＴＬＲ８などのＴＬＲのリガンドであってよい（段落【００９２】～【００９５】，【００９８】）。 オ本願明細書の実施例５の図７，実施例１１の図２１，図２２では，ｈＰ- 59 -ＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）を，（Ａｒｇ）９あるいは（Ａｒｇ）９（Ｈｉｓ）３とルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを，様々な割合（図７では質量比，図２１，２２ではモル比）で混合したＲＮＡ／ペプチド複合体と共に２４時間培養することにより，ｈＰＢＭＣに対する免疫活性効果を，サイトカイン（ＴＮＦα，ＩＬ－６）の産生を検出することによって測定しており，本願補正発明の範囲に含まれるＮ／Ｐ比とモル比（質量比からの換算による）を有する複合体は，サイトカインの産生量が多いことが示されている（段落【０２４１】～【０２４６】，【０２５６】，図７，２１，２２）。 また，実施例６の図８では，（Ａｒｇ）９とルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを，様々な割合（質量比）で混合したＲＮＡ／ペプチド複合体を，ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたところ，本願補正発明の範囲に含まれるＮ／Ｐ比とモル比（質量比からの換算による）を有 ードするｍＲＮＡとを，様々な割合（質量比）で混合したＲＮＡ／ペプチド複合体を，ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたところ，本願補正発明の範囲に含まれるＮ／Ｐ比とモル比（質量比からの換算による）を有する複合体は，ｍＲＮＡから翻訳されたルシフェラーゼの発現量が多いことが示されている（段落【０２４７】，【０２４８】，図８）。 カ本願補正発明の複合化ＲＮＡを用いることにより，ＲＮＡのトランスフェクション効率を改善し，抗原によって誘発される特異的免疫反応，又は非特異的免疫反応を亢進することによって，免疫系を賦活化することができ，それにより腫瘍または癌疾患，（感染性）ウイルス性疾患などの疾病の治療及び／又は予防を行うことができるという効果を奏する（段落【０１７７】，【０１７８】，【０１９２】～【０１９４】）。 ２ 取消事由１（引用発明の認定の誤り）について(1) 引用例１の記載事項等についてア引用例１（甲３。訳文は乙１）には，次のような記載がある。 (ア) 請求項「２９．単離されたカチオン性ペプチドとＲＮＡの非共有結合複合体- 60 -からなる組成物。」（甲３添付の訳文最終頁，乙１，２７頁）「４３．前記ＲＮＡがｍＲＮＡ，アンチセンスＲＮＡ，ＲＮＡｉ，増幅されたＲＮＡやリボザイムから選択される，請求項２９または３０の組成物。」（甲３添付の訳文最終頁）「４５．前記ＲＮＡが１以上の腫瘍細胞や病原体から単離される，請求項２９または３０の組成物。」（甲３添付の訳文最終頁）(イ) 発明の分野「本発明は細胞を形質転換する方法に関する。より具体的には，本発明は，細胞内へのＲＮＡのカチオン性ペプチドを介した形質転換の方法，かかる方法に有用なカチオン性ペプチド，関連するカチオン性ペプチド核酸複 発明は細胞を形質転換する方法に関する。より具体的には，本発明は，細胞内へのＲＮＡのカチオン性ペプチドを介した形質転換の方法，かかる方法に有用なカチオン性ペプチド，関連するカチオン性ペプチド核酸複合体，およびかかる複合体で形質転換された細胞に関する。」（乙１，１頁６～９行目）(ウ) 発明の背景「核酸で細胞を形質転換する従来の方法には，脂質を介した形質転換，ポリＬ－リジン，デンドリマーまたはポリエチレンイミンなどのカチオンに結合するポリマーＤＮＡを用いたトランスフェクション，エレクトロポレーション，リン酸カルシウム形質転換，およびウィルスを介したトランスフェクションが含まれる。 現在では，様々なペプチド，特に，カチオン性ペプチドは細胞内に移行することができ，またタンパク質の細胞内への転座を仲介することもできることが知られている。…」（乙１，１頁１１～１６行目）「いくつかのグループは，共有結合したＤＮＡとＲＮＡに対するペプチドを介したトランスフェクションを報告している。たとえば，アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのＡｎｔＰとＴａｔに対する結合体が標的遺伝子発現を減少させることが示された…。さらに，Ｓｃｈｍｉｔｚらは，…，ジスルフィド結合によりＡｎｔＰに共有結合したｓｉＲ- 61 -ＮＡによる哺乳類細胞のトランスフェクションおよびｍＲＮＡ発現の低減を説明している。 さらに，非共有結合で結合した核酸に対するペプチドを介したトランスフェクションが報告されている。」（乙１，２頁下から１５～６行目）「ＲＮＡトランスフェクションの方法は，ＤＮＡトランスフェクションの方法ほど開発されていない。抗原提示細胞のＲＮＡローディングなどの技術の重要性が高まるにつれてＲＮＡトランスフェクションの進んだ方法を開発するこ スフェクションの方法は，ＤＮＡトランスフェクションの方法ほど開発されていない。抗原提示細胞のＲＮＡローディングなどの技術の重要性が高まるにつれてＲＮＡトランスフェクションの進んだ方法を開発することは決定的に重要となる。しかし，ペプチドを介したＲＮＡトランスフェクションに成功した報告はほとんどなかった。…したがって，細胞の生存率を保持しつつ，細胞に効率的にＲＮＡを送達する進んだ方法を開発する必要性がある。本発明はこの必要性を満たし，また，関連する利点を提供する。」（乙１，４頁４行目～下から５行目）」(エ) 発明の概要「出願人らは，カチオン性ペプチドが，ＲＮＡとペプチドとの共有結合またはＰＥＩ－ペプチド複合体を必要とすることなく効率的なＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを仲介することができることを発見した。 したがって，本発明は，細胞をカチオン性ペプチドおよびＲＮＡに接触させることを含む細胞を形質転換する方法を提供する。該接触はｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのどちらでも行うことができる。好ましい実施形態では，細胞はカチオン性ペプチドとＲＮＡとを含む非共有結合複合体と接触される。好ましくは，該非共有結合複合体は，細胞に接触される前に，（ａ）カチオン性ペプチドをＲＮＡに添加して混合物を形成するステップ，および（ｂ）該混合物をカチオン性ペプチドとＲＮＡとの間で非共有結合複合体が形成できるのに十分な時間培養するス- 62 -テップによって形成される。 また，本発明は細胞をトランスフェクトするのに役立つカチオン性ペプチドの提供も行う。好ましくは，該ペプチドは長さで８～２４個のアミノ酸である。より好ましくは，該ペプチドは長さで１０～２２個のアミノ酸であり，もっとも好ましくは，該ペプチドは長さで１２～２０個のア チドの提供も行う。好ましくは，該ペプチドは長さで８～２４個のアミノ酸である。より好ましくは，該ペプチドは長さで１０～２２個のアミノ酸であり，もっとも好ましくは，該ペプチドは長さで１２～２０個のアミノ酸である。本発明の一実施例では，本発明のカチオン性ペプチドは核局在化シグナルを含まない。好ましくは，該カチオン性ペプチドは本質的にペプチド形質導入ドメインからなる。好ましい実施形態では，カチオン性ペプチドは前記細胞の細胞質に優先的に局在化される。 本発明のさらなる実施形態では，カチオン性ペプチドは，ＡｎｔＰ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ； ＳＥＱＩＤＮＯ： ３），ＨＩＶＴａｔ （ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）またはＨＩＶＴａｔｄｉｍｅｒ （ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：３０），およびそれらの組み合わせから成るグループから選択される。好ましくは，カチオン性ペプチドは，ＭＨＣクラスＩヘルパー・エピトープまたはＭＨＣクラスⅡヘルパー・エピトープなどのＭＨＣヘルパー・エピトープを含む。一実施形態では，ヘルパー・エピトープはカチオン性ペプチドに埋め込まれている。カチオン性ペプチドに埋め込まれたヘルパー・エピトープの好ましい実施形態は，ＲＲＫＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＫＲＨ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３１），ＫＫＫＨＩＥＫＹＬＫＫＩＫＮＳＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３２），ＫＫＫＶＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３３），ＫＫＫＰＫＹＶＲＱＮＴＬＫＬＡＴＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３４），およびＫＫＫＫＡＬＥＮＫＫＫＱＬＧＡＧＧＫＮＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）である。 - 63 -カチオン性ペプチドは，任意のＲ ＶＲＱＮＴＬＫＬＡＴＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３４），およびＫＫＫＫＡＬＥＮＫＫＫＱＬＧＡＧＧＫＮＫＫＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）である。 - 63 -カチオン性ペプチドは，任意のＲＮＡの任意のタイプの細胞の中へのトランスフェクションを仲介するのに役立つ。好ましいＲＮＡは，ｍＲＮＡ，アンチセンスＲＮＡ，ＲＮＡｉ，増幅ＲＮＡおよびリボザイムである。好ましくは，ＲＮＡは翻訳性ＲＮＡである。一実施形態では，ＲＮＡは癌細胞などの１つまたは複数の腫瘍（新生物）細胞から単離される。別の実施形態では，ＲＮＡはＨＩＶまたはＨＣＶなどの１つまたは複数の病原体から単離される。 さらに，本発明は，非共有結合性のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体とカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体でトランスフェクトされた細胞とを含む組成物を提供する。 本発明のカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合体は，未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞のような免疫系の抗原提示細胞の変換のために特に利用される。」（乙１，４頁下から３行目～６頁２行目）(オ) 発明の詳細な説明「用語「抗原」は，当該技術においてよく理解されており，免疫原性の物質，つまり，免疫原を含む。また，任意の抗原を使用することは本発明の使用に想定されており，したがって，限定はされないが，自己抗原（正常なものまたは疾病関連のものを問わず），感染抗原（たとえば，細菌抗原，ウィルス抗原等），または他のいくつかの外来抗原（たとえば，食物成分，花粉等）を含むことは理解されるべきであり認められるであろう。用語，「抗原」または代わりに「免疫原」は，複数の免疫原への免疫応答を同時に調整できるような２以上の免疫原の集合に適用する。さらに，該用語は，免疫原または抗原の任意の様々な異なる配合物を含む。」（乙１，６頁 原」または代わりに「免疫原」は，複数の免疫原への免疫応答を同時に調整できるような２以上の免疫原の集合に適用する。さらに，該用語は，免疫原または抗原の任意の様々な異なる配合物を含む。」（乙１，６頁１３～２０行目）「抗原提示細胞（ＡＰＣ）との用語は，１以上の抗原を，免疫系の特異的エフェクタ細胞によって認識される抗原－ＭＨＣ複合体として提示- 64 -し，それによって，提示された抗原に対して効果的な細胞性免疫反応を誘導することができる細胞集団のことをいう。多くのタイプの細胞がＴ細胞認識のためにその細胞表面上に抗原を提示することができるかもしれないが，樹状細胞（プロフェッショナルＡＰＣ）だけが有効な量の抗原を提示しさらに細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のためにナイーブＴ細胞を活性化させる能力を有している。 ＡＰＣは，限定はされないが，Ｂ細胞，およびマクロファージ，未成熟樹状細胞，成熟樹状細胞およびランゲルハンス細胞などの樹状細胞を含む。」（乙１，６頁下から６行目～７頁２行目）「用語「樹状細胞」（ＤＣ）は，様々なリンパ系組織および非リンパ系組織で見つかった形態学的に類似した多種多様な細胞タイプを指す（Ｓｔｅｉｎｍａｎ （１９９１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：２７１－２９６）。樹状細胞は生体内に最も強力で好ましいＡＰＣを構成する。樹状細胞は単球から分化することができるが，別個の表現型を持っている。たとえば，単球が持っている特別の分化マーカー（ＣＤ １４抗原）は，樹状細胞内で見つからない。また，成熟した樹状細胞は貪食細胞ではないが，単球は貪食性の強い細胞である。成熟したＤＣはＴ細胞の活性化および増殖に必要なシグナルをすべて提供することができることが示されてきている。」（乙１，８頁１０～１６行目）「 は貪食細胞ではないが，単球は貪食性の強い細胞である。成熟したＤＣはＴ細胞の活性化および増殖に必要なシグナルをすべて提供することができることが示されてきている。」（乙１，８頁１０～１６行目）「本明細書で使用される「対象物に免疫応答を誘導すること」という用語は，当該技術において理解された用語であり，対象に抗原（またはエピトープ）を導入した後で，抗原（またはエピトープ）に対する検出または測定可能な応答が，対象に抗原（またはエピトープ）を導入する前に比べて少なくとも約２倍，または少なくとも約５倍，または少なくとも約１０倍，または少なくとも約１００倍，または少なくとも約５０- 65 -０倍，または少なくとも約１０００倍，またはそれ以上増大することを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答には，抗原特異的（またはエピトープ特異的）な抗体の産生，および自身の表面に抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を発現させる免疫細胞の産生が含まれる。」（乙１，８頁下から４行目～９頁４行目）「本発明の目的の場合，「非共有結合で複合体化される」とは，共有結合とは対照的にペプチドと核酸との間で電子が共有されない本発明のペプチドと核酸との間の非共有結合性化学結合または凝集を指す。好ましくは，非共有結合性複合体は正に帯電したカチオン性ペプチドと負に帯電したポリヌクレオチドによって形成される。…」（乙１，１０頁２～５行目）「本発明は，カチオン性ペプチドを介したＲＮＡによる細胞のトランスフェクションの新しい方法を提供する。本発明の該ペプチドは任意の細胞へのＲＮＡの形質転換を仲介することができる。従来技術とは対照的に，本発明の方法は，ＲＮＡとペプチドの共有結合やペプチドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）への共有結合も必要としない。したがって， の細胞へのＲＮＡの形質転換を仲介することができる。従来技術とは対照的に，本発明の方法は，ＲＮＡとペプチドの共有結合やペプチドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）への共有結合も必要としない。したがって，核酸は，細胞の内部でその生物学的機能を一旦保持する可能性が高く，共有結合させる余分なステップの必要性がなくなる。さらに，エレクトロポレーション，カチオン性脂質またはデンドリマーなどの従来技術の形質転換法との比較では，本発明の形質転換法は，細胞の生存率および形質転換効率をより高める。 このように，本発明は，細胞をカチオン性ペプチドおよびＲＮＡを含む複合体と接触させることを含む細胞の形質転換法であって，前記ペプチドと前記ＲＮＡが非共有結合で複合体化している方法を提供する。本明細書で用いられる「形質転換すること」および「トランスフェクションすること」という用語は，交互に用いられて，ＲＮＡを細胞内に導入- 66 -することを指す。」（乙１，１１頁下から３行目～１２頁１０行目）「本発明のカチオン性ペプチド本発明に関するカチオン性ペプチドは，好ましくは長さで８～４０のアミノ酸，より好ましくは，長さで９～３０のアミノ酸，さらにより好ましくは，長さで１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，または２４のアミノ酸，最も好ましくは，長さで１０～２０のアミノ酸である。ポリエチレンイミンに接合したペプチドは，本発明のカチオン性ペプチドから明確に除外される。…本発明のカチオン性ペプチドはそれらの塩基性（カチオン性）アミノ酸成分によりｐＨ７で最終的に正の電荷を有しているが，帯電していないアミノ酸残基および負に帯電したアミノ酸残基を含有することもできる。塩基性側鎖を有するアミノ酸はｐＨ７で正に帯電（カチオン性） ミノ酸成分によりｐＨ７で最終的に正の電荷を有しているが，帯電していないアミノ酸残基および負に帯電したアミノ酸残基を含有することもできる。塩基性側鎖を有するアミノ酸はｐＨ７で正に帯電（カチオン性）しており，リジン（Ｋ），アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）を含む。本発明のカチオン性ペプチドに使用される好ましい塩基性アミノ酸残基はリジンとアルギニンである。 酸性の側鎖を有するアミノ酸はｐＨ７で負に帯電（酸性）しており，アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ），セリン（Ｓ），トレオニン（Ｔ）およびチロシン（Ｙ）を包含する。無極性の側鎖を有するアミノ酸は，アラニン（Ａ），ロイシン（Ｌ），プロリン（Ｐ），メチオニン（Ｍ），グリシン（Ｇ），バリン（Ｖ），イソロイシン（Ｉ），フェニルアラニン（Ｆ），トリプトファン（Ｗ）およびシステイン（Ｃ）を包含する。」（乙１，１２頁１１行目～下から２行目）「細胞内へ移行する能力を持つ多数のカチオン性ペプチドは，当業者に公知であり，本発明の方法，カチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体，および形質転換細胞に役立つ。これらには，限定はされないが，ポリアル- 67 -ギニン（例えば，７～１５のアルギニン，好ましくは，８，９，１０，１１，または１２のアルギニン）（Ｍａｔｓｕｉら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ（２００３）４：１５１－１５７参照）・・・，またはそれらの組み合わせ任意のものから成るグループから選択される。」（乙１，１４頁下から５行目～１５頁下から９行目）「当業者なら，当業者らに公知の方法で付加的なカチオン性ペプチドがＲＮＡトランスフェクションを仲介する能力を容易に決定することができる。好ましくは，遺伝子導入されたＲＮＡにコードされた１または複数のポリペプチドの 業者らに公知の方法で付加的なカチオン性ペプチドがＲＮＡトランスフェクションを仲介する能力を容易に決定することができる。好ましくは，遺伝子導入されたＲＮＡにコードされた１または複数のポリペプチドのタンパク質産生が測定される。タンパク質を検出する方法は，当業者らに公知であり，それらの方法には，限定はされないが，ウェスタン・ブロット法，細胞外染色，抗生物質耐性などのマーカーの検出，ルシフェラーゼ，βガラクトシダーゼ等が包含される。代わりに本発明では，標識を付けたＲＮＡ（例えば，蛍光標識されたＲＮＡ，または３２Ｐで標識付けしたＲＮＡ）を関心のあるカチオン性ペプチドと前もって混合し，次に細胞培養に加え，約３０～６０分間インキュベートし，培地を取り除き細胞を洗浄し，次いで細胞に残った標識を標準的な技術で測定する。」（乙１，１５頁下から８行目～１６頁１行目）「好ましい実施形態では，ＲＮＡは翻訳可能なＲＮＡであり，そして本発明のカチオン性ペプチドおよびカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体は，選択的に，細胞質を標的とするか，または細胞質内に局在する。細胞質で翻訳が生じるので細胞質を標的とするのが好ましい。一実施形態では，該カチオン性ペプチドは本質的にペプチド形質導入ドメインからなる。 ＲＮＡから翻訳されたタンパク質は，本発明の方法で細胞に送達され，- 68 -当該技術分野で公知の方法で検出することができる。タンパク質分析には当該技術分野で様々な技法が利用可能であり，それらの技法には，限定はされないが，放射免疫測定法，ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射測定法），「サンドイッチ」免疫測定法，免疫蛍光分析法，およびＰＡＧＥ－ＳＤＳが含まれる。 本発明の目的の場合，ペプチド形質導入ドメインは，他の細胞小器官（例えば，細胞膜，核，ミトコンドリア，色素体， 法），「サンドイッチ」免疫測定法，免疫蛍光分析法，およびＰＡＧＥ－ＳＤＳが含まれる。 本発明の目的の場合，ペプチド形質導入ドメインは，他の細胞小器官（例えば，細胞膜，核，ミトコンドリア，色素体，小胞体，ゴルジ装置など）とは対照的に，選択的に細胞質内に局在するアミノ酸配列を指す。 好ましくは，本発明のカチオン製ペプチドの少なくとも５０％，６０％，７０％，８０％，または少なくとも９０％は，細胞質に局在する。」（乙１，１６頁７～１９行目）「本発明のペプチドは，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，モデル４３０Ａまたは４３１Ａ（米国，カリフォルニア州，フォスター市）で製造されたもののような，市販の自動ペプチド合成器を用いた化学合成などの当業者に公知の様々な方法によって得ることができる。」（乙１，１９頁下から１１～９行目）「ＲＮＡ本発明のカチオン性ペプチドは，限定はしないが，一次ＲＮＡ転写物，ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡｉ），リボザイム，アンチセンスＲＮＡ，増幅ＲＮＡ等を含む任意のタイプのＲＮＡを持つ任意のタイプの細胞の形質転換に使用することができる。 好ましい実施形態では，ＲＮＡは翻訳可能なＲＮＡである。翻訳可能なＲＮＡという用語は，ＲＮＡがオープン・リーディング・フレームの両側に位置する機能的な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むこと，および，ＲＮＡが，細胞内に導入された際に，翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルを認識する翻訳機構でペプチドまたはポリペプ- 69 -チドに翻訳されることを意味する。 ＲＮＡは，一つまたは複数の細胞から抽出でき，または従来の分子技術を用いてｉｎｖｉｔｒｏで産生することができる。ＲＮＡは，ｃＤＮＡへの逆転写，続いてＰＣＲ増 チドに翻訳されることを意味する。 ＲＮＡは，一つまたは複数の細胞から抽出でき，または従来の分子技術を用いてｉｎｖｉｔｒｏで産生することができる。ＲＮＡは，ｃＤＮＡへの逆転写，続いてＰＣＲ増幅およびｉｎｖｉｔｒｏでの転写により増幅することができる。かかる方法は当業者には公知である。…好ましい実施形態では，ＲＮＡは病原体，または，癌細胞などの新生物（腫瘍）細胞からのものである。好ましい実施形態では，抗原は腫瘍細胞または病原体からのものである。好ましくは，腫瘍細胞は腎癌の癌細胞，多発性骨髄腫細胞，慢性リンパ性白血病細胞，またはメラノーマ細胞である。好ましい病原体は，ＨＴＶおよびＨＣＶである。好ましい実施形態では，抗原は，癌細胞または病原体から単離された，または由来するＲＮＡの形で，抗原提示細胞に送達される。」（乙１，２０頁５行目～下から４行目）「標的細胞本発明の方法および組成物は，原核細胞および真核細胞，培地内の細胞，組織断片内の細胞，またはヒトを含む動物内の細胞を含む任意のタイプの細胞を形質転換するのに使用することができる。好ましい実施形態では，細胞は真核細胞である。 本発明の一実施例では，標的細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞には，限定はされないが，肺胞マクロファージ，腹腔マクロファージおよび脾臓マクロファージを含むマクロファージ；単球；ランゲルハンス細胞，未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む樹状細胞が含まれる。 好ましい実施形態では，標的細胞は樹状細胞である。「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は，様々なリンパおよび非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞形態の多様な個体群を表す…。樹状細胞は，ＡＰＣのうちで最も強力であり，Ｔ細胞の活性化および増殖に必要なシグナル- 70 -を提供する。樹状細胞は骨髄 リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞形態の多様な個体群を表す…。樹状細胞は，ＡＰＣのうちで最も強力であり，Ｔ細胞の活性化および増殖に必要なシグナル- 70 -を提供する。樹状細胞は骨髄先祖細胞に由来し，少数が末梢血中を循環し，未成熟ランゲルハンス細胞または最終分化した成熟細胞のいずれかとして出現する。また，樹状細胞は単球から分化することもできる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を単離する方法，ならびに樹状細胞前駆体および成熟樹状細胞を産生する方法は当業者に公知である。」（乙１，２１頁５～２０行目）「未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞は，本発明のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体を使用してトランスフェクトされることができる。トランスフェクトされた樹状細胞は，腫瘍および病原体感染などの疾病の治療に役立つ。」（乙１，２３頁２～４行目）「カチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体本発明はさらに，カチオン性ペプチドとＲＮＡの単離された非共有結合複合体からなる組成物を提供する。正電荷を持つカチオン性ペプチドと負電荷を持つＲＮＡは，イオン結合を介して非共有結合複合体を形成する。本発明のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体は，一つのカチオン性ペプチドと複数のＲＮＡ，複数のカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡ，一つのカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡで形成される複合体を包含する。カチオン性ペプチドの長さ，配列，電荷は，ＲＮＡの長さ，配列，及び，それらの濃度と同様に，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比を決定するための関連要因である。効率的な複合体形成や導入のために，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比や濃度を最適化することは当業者にとって容易である。好ましい比は，ＲＮＡ分子に対してカチオン性ペプチドが１－１００である。 本発明のカチオン性ペプチド‐ＲＮＡ組成物は，カチ ン性ペプチドとＲＮＡの比や濃度を最適化することは当業者にとって容易である。好ましい比は，ＲＮＡ分子に対してカチオン性ペプチドが１－１００である。 本発明のカチオン性ペプチド‐ＲＮＡ組成物は，カチオン性脂質，中性脂質，デンドリマー，クロロキン，リソソーム親和性薬剤，または，かかる混入物がないときのカチオン性ペプチド‐ＲＮＡのトランスフェ- 71 -クション効率と比べ，カチオン性ペプチド‐ＲＮＡのトランスフェクション効率が５％以上増加するのに十分な他の薬剤の量を含んではならない。 カチオン性ペプチド‐ＲＮＡ複合体は，カチオン性ペプチドおよびＲＮＡを，トランスフェクションのための標的細胞を含む環境に添加する前に形成することができ，または複合体はトランスフェクションのための標的細胞を含む環境で形成される。たとえば，組織培養中の標的細胞であれば，予め形成したカチオン性ペプチド‐ＲＮＡ複合体を組織培地に添加してよく，またはＲＮＡおよびカチオン性ペプチドを別個に添加し培地中で結合させてよい。より高次の生命体中の標的細胞であれば，予め形成したカチオン性ペプチド‐ＲＮＡを生命体に導入することが好ましい。１つの実施形態で，カチオン性ペプチドおよびＲＮＡをＰＢＳ中で混合し，室温で１～６０分間または一晩インキュベートし，ペプチド：ＲＮＡ複合体を形成させる。インキュベーションの温度は決定的ではないが，好ましい実施形態では１～５０℃の範囲内である。 本発明は，また，カチオン性ペプチド‐ＲＮＡ複合体からなる医薬組成物，および薬学的に許容可能な担体を提供する。」（乙１，２３頁９行目～２４頁４行目）「標的細胞の形質転換カチオン性ペプチドと核酸はｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞に送達することができる。カチオン性ペプチドと核酸は，ＲＮＡまたは （乙１，２３頁９行目～２４頁４行目）「標的細胞の形質転換カチオン性ペプチドと核酸はｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞に送達することができる。カチオン性ペプチドと核酸は，ＲＮＡまたはカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体の細胞内への取り込みに帰着するのに効果的な任意のＲＮＡ濃度で使用することができる。かかる有効な濃度は，一般的に，細胞培養内のＲＮＡで１ナノグラム／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌまでの範囲にある。 当業者なら，ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの使用のため- 72 -の最適な濃度を決定することができる。 好ましい実施形態では，カチオン性ペプチドとＲＮＡを水溶液中で混合し，その後，共に細胞培地に加えるか，または動物，好ましくは，ヒトに投与する。好ましくは，混合液を細胞培地に加えるか，または投与する前に，カチオン性ペプチドとＲＮＡを複合体が形成可能になる十分な時間インキュベートする。あるいは，カチオン性ペプチドとＲＮＡをどちらの順序でも，組織培養，またはヒトあるいは動物の対象などを含む環境に別々に加えることができる。 組織培養内の細胞のトランスフェクションの場合，カチオン性ペプチドとＲＮＡを加える前に細胞をＰＢＳなどの生理的緩衝溶液で洗浄することができる。これらの細胞をカチオン性ペプチドとＲＮＡ（好ましくは予め形成した複合体）に任意の時間接触させることができる。好ましくは，少なくとも１分，好ましくは，５分から２時間，これらの細胞をカチオン性ペプチドとＲＮＡに接触させることができる。トランスフェクション培地を使用する場合は，該トランスフェクション培地を接触期間の後に除去し，適切な細胞培地と取り替えることができる。 本発明は，上述のロードした抗原提示細胞を含むワクチンをさらに提供する。」（乙１，２４頁９行目～下から４ 該トランスフェクション培地を接触期間の後に除去し，適切な細胞培地と取り替えることができる。 本発明は，上述のロードした抗原提示細胞を含むワクチンをさらに提供する。」（乙１，２４頁９行目～下から４行目）「抗原提示細胞を単離し，調製し，トランスフェクトし，配合し，患者に投与するする方法は，当該技術分野で公知である。」（乙１，２５頁６～７行目）(カ) 実施例「実施例１ヒーラ細胞へのカチオン性ペプチドを介したＧＦＰ－ＲＮＡの導入Ｐｏｒｔ－２（ＡｎｔＰ： ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；ＳＥＱＩＤＮ０：３），Ｐｏｒｔ－３ （ＨＩＶＴａｔ： Ｇ- 73 -ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：２９），またはＰｏｒｔ－４ （Ｐｏｒｔ－３ ｄｉｍｅｒ：ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ； ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）カチオン性ペプチドが，ヒーラ細胞に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを導入するために使用される。Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，１００：１～１：１の範囲である。 Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，ＲＮＡ分子数へのペプチド分子数の割合として，分子間の電荷比によって算出される。 Ｐｏｒｔペプチドは，所望の割合で適切な濃度にＰＢＳ中に希釈される。Ｐｏｒｔペプチド１００μｌは，ＲＮＡ１００μｌ（２０μｇ／ｍｌ）と混合され，室温にて３０分間培養されることで複合体を形成する。接着ヒーラ細胞は，４ｍｌＰＢＳで洗浄される。２００μｌのＰｏｒｔ：ＲＮＡ複合体が，洗浄された細胞に滴下され，続いて４００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ）が滴下される。Ｐｏｒｔ：ＲＮＡ複合体溶液で被覆された細胞は，３７℃で１時間培養され，１ｍｌの完全ヒーラ培地（１０％ＦＢＳ添 体が，洗浄された細胞に滴下され，続いて４００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ）が滴下される。Ｐｏｒｔ：ＲＮＡ複合体溶液で被覆された細胞は，３７℃で１時間培養され，１ｍｌの完全ヒーラ培地（１０％ＦＢＳ添加のＤＭＥＭ）が細胞に添加される。 細胞は３７℃で一昼夜培養され，トリプシン消化処理により採取され，フローサイトメトリーで緑色蛍光タンパク質の発現を測定される。」（乙１，２６頁下から１３行目～２７頁３行目）イ上記アの引用例１の記載によれば，引用例１には，前記第２の３(2)アの引用発明が記載されているものと認められる。 ウこれに対し，原告は，①引用例１には実験結果の記載がなく，形質転換できるという効果を奏する複合体が得られることや，仮に複合体が得られたとしても，引用例１に記載された性質を示すことは確認できないのであるから，実施可能なものとして完成した発明が記載されているとはいえない，②引用例１の記載から配列番号２９のペプチドを選択することは当業- 74 -者において容易ではないから，引用例１の記載に基づいて引用発明を認定することはできず，本件審決の認定は誤りである旨主張する。 (ア) しかしながら，まず①についていうと，特許法２９条２項，同条１項３号所定の「刊行物に記載された発明」というためには，特許出願当時の技術水準を基礎として，当業者が当該刊行物を見たときに，特許請求の範囲の記載により特定される特許発明等の内容との対比に必要な限度において，その技術的思想を実施し得る程度に技術的思想の内容が開示されていることが必要であり，かつ，それで足りると解するのが相当である。 そこで，上記の観点から引用例１に上記の程度の開示がされているかどうかを検討すると，引用例１には，核酸で細胞を形質転換する従来の方法には，脂質を介した形質転換，ポリＬ ると解するのが相当である。 そこで，上記の観点から引用例１に上記の程度の開示がされているかどうかを検討すると，引用例１には，核酸で細胞を形質転換する従来の方法には，脂質を介した形質転換，ポリＬ－リジン，デンドリマーまたはポリエチレンイミンなどのカチオンに結合するポリマーＤＮＡを用いたトランスフェクション，エレクトロポレーション，リン酸カルシウム形質転換，及びウィルスを介したトランスフェクションが含まれ，様々なペプチド，特に，カチオン性ペプチドは細胞内に移行することができ，またタンパク質の細胞内への転座を仲介することもできることが知られており，さらに，非共有結合で結合した核酸に対するペプチドを介したトランスフェクションが報告されていたが，ＲＮＡトランスフェクションの方法は，ＤＮＡトランスフェクションの方法ほど開発されていなかったこと（前記(1)ア(ウ)），引用例１記載の発明が，細胞の生存率を保持しつつ，細胞に効率的にＲＮＡを送達する進んだ方法を提供するものであること（前記(1)ア(ウ)），出願人らは，カチオン性ペプチドが，ＲＮＡとペプチドとの共有結合又はＰＥＩ－ペプチド複合体を必要とすることなく効率的なＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを仲介することができることを発見したこと（前記(1)ア(エ)）が記載されており，- 75 -これらをまとめれば，ＤＮＡを用いてされていたトランスフェクションにつき，ＲＮＡについても，カチオン性ペプチドを用いることにより効率的になし得ることを発見したことが記載されている。 さらに，引用例１の「標的細胞の形質転換」の項には，カチオン性ペプチドと核酸はｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞に送達することができること，カチオン性ペプチドと核酸は，ＲＮＡ又はカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体の細胞内 胞の形質転換」の項には，カチオン性ペプチドと核酸はｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞に送達することができること，カチオン性ペプチドと核酸は，ＲＮＡ又はカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体の細胞内への取り込みに帰着するのに効果的な任意のＲＮＡ濃度で使用することができること，かかる有効な濃度は，一般的に，細胞培養内のＲＮＡで１ナノグラム／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌまでの範囲にあるが，当業者であれば，ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏでの使用のための最適な濃度を決定できること，好ましい実施形態としてカチオン性ペプチドとＲＮＡを水溶液中で混合し，その後，共に細胞培地に加えるか，または動物，好ましくは，ヒトに投与する形態があること，組織培養内の細胞のトランスフェクションを行う場合の手法がそれぞれ記載されており（前記(1)ア(オ)），形質転換を行う場合の手法が開示されている。 その上で，引用例１には，「実施例１」として，ＲＮＡと組み合わせるカチオン性ペプチドとして，配列番号３，２９及び３０のＰｏｒｔカチオン性ペプチドが記載され，そのうちの，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドが引用発明の認定の基礎とされているものであるところ，実施例１では，上記Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡの複合比を１００：１～１：１とした非共有結合複合体を，ヒーラ細胞へ滴下し，培養したのち，緑色蛍光タンパク質の発現を測定すること，上記の複合比は，ＲＮＡ分子数へのペプチド分子数の割合として，分子間の電荷比によって算出されるものであることが記載されており（前記(1)ア(カ)），具体的な複合体に用いられるカチ- 76 -オン性ペプチドの内容及び複合の際のカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比やその算出方法も記載されている。 以上の引用例１の記載 り（前記(1)ア(カ)），具体的な複合体に用いられるカチ- 76 -オン性ペプチドの内容及び複合の際のカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比やその算出方法も記載されている。 以上の引用例１の記載に照らすと，引用例１には，ＲＮＡトランスフェクションの方法は，ＤＮＡトランスフェクションの方法ほど開発されていなかったところ，ＲＮＡについて，ＤＮＡと同様にトランスフェクションを行うに際し，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比が１００：１～１：１の範囲である複合体を採用し，引用例１記載の方法により，ＲＮＡを細胞内へ導入し，形質転換することにより，細胞の生存率を保持しつつ，細胞に効率的にＲＮＡを送達することができるという技術的思想が，当業者にとって，実施し得る程度に，かつ，特許発明と対比するに必要な程度に開示されていることが認められる。したがって，原告の上記①の主張は理由がない。 (イ) また，②についても，引用例１に他の本願補正発明の構成を有しないペプチドが開示されていたとしても，前記(ア)のとおり，引用例１には実施例１として，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドと緑色蛍光タンパク質をコードするＲＮＡの非共有結合複合体であって，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比が１００：１～１：１の範囲である複合体，すなわち引用発明が技術思想として開示されている以上，これを引用発明として認定することに誤りはない。原告は，引用例１の記載からＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドを選択することが当業者において容易でない旨主張し，容易想到性を問題とするかのようであるが，引用例１に本願補正発明の構成と一致しない他のペプチドが開示されているとしても， ｒｔ－３カチオン性ペプチドを選択することが当業者において容易でない旨主張し，容易想到性を問題とするかのようであるが，引用例１に本願補正発明の構成と一致しない他のペプチドが開示されているとしても，上記複合体が引用例１に前記(ア)のとおりの技術思想として記載されている以上，上記開示が上記複合体を引用発明として認定する- 77 -ことの妨げとなるものではないし，引用発明の認定の場面において，選択が容易かどうかを問題とすべきものでもない。 したがって，原告の上記②の主張も理由がない。 (2) 以上によれば，引用例１から引用発明した本件審決に誤りはなく，原告主張の取消事由１は理由がない。 ３ 取消事由２（相違点(1)の容易想到性の判断の誤り）について原告は，本願発明における「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」は，免疫反応を活性化する生得（抗原非依存性）の効果を有するものであり，かつ，それ自体が免疫活性効果を有するという性質を有するものであるのに対し，引用例１には，トランスフェクトされるｍＲＮＡから細胞質基質において翻訳されたタンパク質抗原が抗原提示細胞上に提示され，これにより免疫反応を引き起こすこと，すなわち従来から知られている抗原特異的な免疫応答が開示されているにとどまるから，本願補正発明に係る免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡと，引用例１に開示されている複合体とでは，免疫を誘導するための機構が全く異なり，当業者が引用例１に基づき相違点(1)に係る構成を容易に想到し得たものということはできない旨主張する。 (1) 本願補正発明の「免疫活性化」の意義についてア本願の特許請求の範囲（請求項１）には，「免疫活性化」に関し，本願発明の「複合化一本鎖ＲＮＡ」が，「１つ以上のオリゴペプチドと複合化された少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を 性化」の意義についてア本願の特許請求の範囲（請求項１）には，「免疫活性化」に関し，本願発明の「複合化一本鎖ＲＮＡ」が，「１つ以上のオリゴペプチドと複合化された少なくとも１つのＲＮＡ（分子）を包含する免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」であること，及び，上記「複合化一本鎖ＲＮＡ」が「腫瘍または癌疾患，循環器病，感染症，（感染性）ウイルス性疾患，自己免疫疾患，（単）遺伝子疾患，および／またはアレルギーから選択される疾病の処置および／または予防における治療用」であることが規定されているが，「免疫活性化」の意義につき，非特異的な免疫反応を誘発することにより免疫活性化をすることを指すのか，抗原によって誘発される特異的な免疫反応- 78 -を誘発することにより免疫活性化をすることを指すのかを特定する記載はなく，また，具体的にどのような機序により「免疫活性化」がされ，上記の疾病の処置及び／又は予防における治療に用いられるかについて特定する記載もない。ましてや，「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」それ自体が，非特異的な免疫反応を誘発することを明示した記載はない。 イ次に，本願明細書（甲１）には，「免疫活性化」の語を定義した記載はない。 そして，確かに，前記１(1)オ及び(2)エのとおり，本願明細書の段落【００５９】ないし【００６１】には，本願補正発明におけるＲＮＡとして，生来の免疫反応を誘発できるアジュバントタンパク質をコードするＲＮＡを用いると，ｍＲＮＡの翻訳を介して生来の免疫反応を活性化することもできることが記載されているほか，段落【００９２】ないし【００９５】には，ＴＬＲのリガンドを表すＲＮＡ配列を含む免疫活性化ＲＮＡが，非特異的な免疫活性化（免疫応答）を亢進するために使用できることが記載されていることなどから，本願明細書には，本願 ないし【００９５】には，ＴＬＲのリガンドを表すＲＮＡ配列を含む免疫活性化ＲＮＡが，非特異的な免疫活性化（免疫応答）を亢進するために使用できることが記載されていることなどから，本願明細書には，本願補正発明の「複合化一本鎖ＲＮＡ」を用いて，非特異的な免疫反応を誘発することにより免疫活性化をする複合化一本鎖ＲＮＡが記載されていることが認められる。 しかしながら，他方で，前記１(1)カ及び(2)エのとおり，本願明細書段落【００７０】には，「本発明の複合化ＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡ（分子）は，抗原をコードしていてもよい。本発明では「抗原」という用語は，免疫系によって認識され，例えば抗体を形成することによって抗原特異的な免疫応答を誘発できる物質を指す。…内因性抗原としては，…細胞内で発生するウイルス起源の抗原をも含む。内因性抗原の分類の１つが，腫瘍抗原の分類である。」の記載があり，段落【０１７４】には「適切な免疫活性化を実現する薬学的組成物を得るために，１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡを直接血液細胞にトランスフェクトすれば，免疫活性化を- 79 -成功させるには充分なのである。」の記載があり，段落【０１７６】には「また，ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで使用されてもよいトランスフェクション法は，例えば本発明において言及される各種疾病の治療法としてｉｎｖｉｖｏで使用しても非常に適切である。…特定の疾病の治療および／または予防は，通常，本発明の複合化ＲＮＡのＲＮＡによってコードされた適切なタンパク質の選択に左右される。」との記載がある。 また，本願明細書段落【０２４７】及び【０２４８】の実施例６及び図８では，本願補正発明に係る複合体をＨｅＬａ細胞に作用させると，ルシフェラーゼｍＲＮＡが翻訳されてルシフェラーゼ（タンパク質）が産生さ また，本願明細書段落【０２４７】及び【０２４８】の実施例６及び図８では，本願補正発明に係る複合体をＨｅＬａ細胞に作用させると，ルシフェラーゼｍＲＮＡが翻訳されてルシフェラーゼ（タンパク質）が産生されることが記載されており，これは，抗原をコードするｍＲＮＡを用いれば，ｍＲＮＡの翻訳を介した抗原特異的な免疫が活性化されることを示すものといえる。 そして，前記１(2)カのとおり，本願明細書には，本願補正発明の複合化一本鎖ＲＮＡを用いることにより，ＲＮＡのトランスフェクション効率を改善し，抗原により誘発される特異的免疫反応，又は非特異的免疫反応を亢進することによって，免疫系を賦活化することができ，それにより腫瘍または癌疾患，（感染性）ウイルス性疾患などの疾病の治療及び／又は予防を行うことができるという効果を奏する（段落【０１７７】，【０１７８】，【０１９２】～【０１９４】）ことが記載されている。 以上によると，本願明細書には，抗原をコードするＲＮＡを用いると，複合化されたｍＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされた後，ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されて抗原が産生され，特異的な免疫反応を誘発することにより免疫活性化をするという作用をする複合化一本鎖ＲＮＡも記載されているものと認められる。 さらに，本願明細書の段落【００２３】に，「本発明の文脈において，複合化ＲＮＡとは，本発明において定義するように，実験式（Ａｒｇ）ｌ- 80 -；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘによって表わされる１つ以上のオリゴペプチドでもって，ＲＮＡとオリゴペプチドとの間で非共有的複合体を形成することによって複合化された，ＲＮＡ（分子），好ましくはｍＲＮＡであると理解すべきである。…ＲＮＡと少なくとも１つのオリゴペプチドとの連結は，複合体の解離平衡 ペプチドとの間で非共有的複合体を形成することによって複合化された，ＲＮＡ（分子），好ましくはｍＲＮＡであると理解すべきである。…ＲＮＡと少なくとも１つのオリゴペプチドとの連結は，複合体の解離平衡状態にある。細胞内については，理論に縛られるわけではないが，ＲＮＡとオリゴペプチドとが解離した状態の方で平衡であるように思われる。」との記載があること，前記実施例６及び図８において，本願補正発明に係る複合体をＨｅＬａ細胞に作用させると，ルシフェラーゼｍＲＮＡが翻訳されてルシフェラーゼ（タンパク質）が産生されることが記載されており，これは，抗原をコードするｍＲＮＡを用いれば，ｍＲＮＡの翻訳を介した抗原特異的な免疫が活性化されることが示されていることに照らすと，本願明細書には，オリゴペプチドと解離した状態のｍＲＮＡが，抗原特異的な免疫活性化の効果をもたらす「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」も記載されていることが認められる。 ウ 「免疫」の一般的な語義についてみても，「岩波生物学辞典第４版」（平成８年３月２１日発行）（乙３）の「免疫反応」の項には「免疫現象に関係のある物質や細胞の生体内および生体外での反応の総体．免疫応答，抗原と抗体や補体との反応，免疫応答によって生じた機能細胞と抗原との反応など．」の記載があり，「免疫反応」につき抗原によって誘発されるものも含むことが認められることに照らすと，「免疫」の一般的な意味としては，非特異的なものに限られるものとは解されない。 これに対し，原告は，「免疫活性化」とは，免疫反応を活性化する生得（抗原非依存性）の効果を指すために一般的に広く用いられるものであるとして，「免疫」につき，非特異的な免疫を指すことが一般的である旨主張するが，これを裏付ける証拠の提出はなく，原告の上記主張は採用する 原非依存性）の効果を指すために一般的に広く用いられるものであるとして，「免疫」につき，非特異的な免疫を指すことが一般的である旨主張するが，これを裏付ける証拠の提出はなく，原告の上記主張は採用する- 81 -ことができない。 エ以上によると，本件補正発明における「免疫活性化」は，その機序を問わず単に「免疫」を「活性化」することを特定するにとどまるのであって，非特異的な免疫（生得の免疫）と抗原特異的な免疫の両方の免疫の活性化を包含するものであり，非特異的な免疫（生得の免疫）に限定されることを意味するものと解することはできないし，本件補正発明の「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」それ自体が，非特異的な免疫活性化をもたらすもののみに限定されるものと解することもできない。 オこれに対し，原告は，本願補正発明が，「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」自体が，非特異的な免疫反応をもたらすもののみを特定することの根拠として，本願明細書の段落【００６０】，実施例５（段落【０２４１】～【０２４６】）及び図７の記載を挙げる。 確かに，本願明細書の実施例５及び図７ではルシフェラーゼｍＲＮＡとノナアルギニンとの複合体によりｈＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）からのＴＮＦαの産生が誘導されており，これは非特異的な免疫反応が生じていることを裏付けるものである。 しかしながら，本願明細書には，抗原をコードするＲＮＡを用いると，複合化されたｍＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされた後，ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されて抗原が産生され，特異的な免疫反応を誘発することにより免疫活性化をするという複合化一本鎖ＲＮＡも記載されていること，オリゴペプチドと解離した状態のｍＲＮＡが免疫活性化の効果をもたらす「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」も記載されていることは前 ことにより免疫活性化をするという複合化一本鎖ＲＮＡも記載されていること，オリゴペプチドと解離した状態のｍＲＮＡが免疫活性化の効果をもたらす「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」も記載されていることは前記イのとおりであるから，本願明細書の段落【００６０】，実施例５及び図７の記載は，本願補正発明が，非特異的な免疫（生得の免疫）活性化の効果をもたらす物を包含することを示す一例の記載にすぎないというほかなく，これらの記載が上記エの認定を覆すものではない。 - 82 -なお，本願明細書の段落【００９４】には，本願補正発明の「免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ」それ自体が非特異的免疫活性を有することが記載されているように理解し得る記載もあるが，上記に説示したところに照らせば，この記載も本願補正発明の一例を示すにすぎないものと認められる。 以上によると，原告の上記主張は理由がない。 (2) 引用例１記載の「免疫」の意義について前記２(1)のとおり，引用例１には，「本明細書で使用される「対象物に免疫応答を誘導すること」という用語は，…抗原（またはエピトープ）に対する検出または測定可能な応答が…少なくとも約２倍，…またはそれ以上増大することを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答には，抗原特異的（またはエピトープ特異的）な抗体の産生，および自身の表面に抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を発現させる免疫細胞の産生が含まれる。」（前記２(1)ア(オ)。乙１，８頁下から４行～９頁４行），「好ましい実施形態では，ＲＮＡは翻訳可能なＲＮＡである。」（前記２(1)ア(オ)。乙１，２０頁９行目），「好ましい実施形態では，ＲＮＡは病原体，または，癌細胞など新生物（腫瘍）細胞からのものである。好ましい実施形態では，抗原は腫瘍細胞または病原体 る。」（前記２(1)ア(オ)。乙１，２０頁９行目），「好ましい実施形態では，ＲＮＡは病原体，または，癌細胞など新生物（腫瘍）細胞からのものである。好ましい実施形態では，抗原は腫瘍細胞または病原体からのものである。…好ましい実施形態では，抗原は，癌細胞または病原体から単離された，または由来するＲＮＡの形で，抗原提示細胞に送達される。」（前記２(1)ア(オ)。乙１，２０頁２４～２９行目），「未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞は，本発明のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体を使用してトランスフェクトされることができる。トランスフェクトされた樹状細胞は，腫瘍および病原体感染などの疾病の治療に役立つ。」（前記２(1)ア(オ)。乙１，２３頁２～４行目）との記載がある。 上記の各記載に照らすと，引用例１に記載された「免疫」は，細胞に，抗原をコードするｍＲＮＡを用いた複合体をトランスフェクトすることによ- 83 -り，ｍＲＮＡの翻訳を介して抗原が産生され，その抗原により誘導される抗原特異的免疫を意図していること，特に，腫瘍細胞又は病原体の抗原をコードするｍＲＮＡを用いた複合体を，腫瘍又は病原体感染等の疾病の治療に役立てるものであることが理解できる。 (3) 相違点(1)の容易想到性の判断について前記(1)及び(2)によると，本願補正発明と引用例１に記載された「免疫」とは，いずれも，抗原特異的免疫を含む点で一致している。 そして，前記(2)の引用例１の記載に接した当業者であれば，腫瘍や病原体感染等の疾病の治療に用いるために，引用発明に係る複合体において，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡに代えて，腫瘍細胞や病原体の抗原をコードするｍＲＮＡを用いることにより，ｍＲＮＡの抗原への翻訳を介して免疫反応を誘導（免疫を活性化）し，引用発明 体において，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡに代えて，腫瘍細胞や病原体の抗原をコードするｍＲＮＡを用いることにより，ｍＲＮＡの抗原への翻訳を介して免疫反応を誘導（免疫を活性化）し，引用発明において，相違点１に係る本願補正発明の構成とすることは，容易に想到することができたものと認められる。 したがって，本件審決の判断に誤りはなく，原告の主張の取消事由２は理由がない。 ４ 取消事由３（相違点(2)の容易想到性の判断の誤り）について(1) 本願優先日当時の技術水準についてア本願優先日前に頒布された文献には以下の記載がある。 (ア) Basicpeptidesystemforefficientdeliveryofforeigngenes,BiochimicaetBiophysicaActa, vol.1640,p.129-136（平成１５年）（乙４）「本研究で我々は，様々な細胞株を効率的にトランスフェクトするＤＮＡ複合体を形成するアルギニンペプチドについて報告した。ペプチドのトランスフェクション能力が，２９３Ｔ，ＨｅＬａ，Ｊｕｒｋａｔ，及びＣＯＳ－７細胞における緑色蛍光タンパク質とβガラクトシダーゼ- 84 -の遺伝子発現により観察された。」（要約の３～５行）「３．１ ペプチド／ＤＮＡ複合体の構造ペプチド／ＤＮＡ複合体の構造を評価するため，正のペプチド／負のＤＮＡの電荷比に応じた複合体間の静電相互作用を測定するのにゲル電気泳動遅延が使用された。」（１３１頁右欄２１～２５行）「β－ガラクトシダーゼの最高のトランスフェクションと発現は，ペプチド／ＤＮＡ電荷比３：１で得られ，２９３ＴとＨｅＬａ細胞株でのペプチド濃度１μＭに対応する（図３）。」（１３２頁右欄９～１２行）「図３ ラクトシダーゼの最高のトランスフェクションと発現は，ペプチド／ＤＮＡ電荷比３：１で得られ，２９３ＴとＨｅＬａ細胞株でのペプチド濃度１μＭに対応する（図３）。」（１３２頁右欄９～１２行）「図３ ペプチド／ＤＮＡ複合体のトランスフェクションにおける電荷比の影響。細胞（２９３ＴまたはＨｅＬａ）は，試作されたペプチド／ＤＮＡ複合体（ペプチド／ＤＮＡの電荷比が最大１６：１まで変化）の存在下で２時間培養され，その後，それらは完全培地で置換された。 ４８時間後，細胞抽出物を作成し，β－ガラクトシダーゼ活性が材料，方法の項に記述されるとおり決定された。実験はそれぞれのサンプルで少なくとも３回実施された。示された結果は，それぞれの測定において，平均値と標準偏差である。」（１３３頁図３の説明文）(イ) 特表２００６－５１９０２６号公報（乙５）「【請求項１４】標的物質を細胞内へ導入するための組成物であって，Ａ）標的物質，Ｂ）アクチン作用物質，を含む，組成物。 【請求項１５】前記標的物質は，ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリペプチド，糖およびこれらの複合体からなる群より選択される物質を含む，請求項１４に記載の組成物。」「【０２８５】…予想したように，高いトランスフェクション効率を実現するため- 85 -の重要な因子は，ポリマー内の窒素原子（Ｎ）の数とプラスミドＤＮＡ内のリン酸残基（Ｐ）の数との間の電荷バランス（Ｎ／Ｐ比率），ならびにＤＮＡ濃度である。一般的に，Ｎ／Ｐ比率および濃度における増大は，トランスフェクション効率の増大を生じる。並行して，本発明者らは，ｈＭＳＣの溶液トランスフェクション実験における高いＤＮＡおよび高いＮ／Ｐ比率の場合に，細胞生存率の有意な低下を観察した。…ＳＰＴＡの場合，１０のＮ／Ｐ比率が 増大を生じる。並行して，本発明者らは，ｈＭＳＣの溶液トランスフェクション実験における高いＤＮＡおよび高いＮ／Ｐ比率の場合に，細胞生存率の有意な低下を観察した。…ＳＰＴＡの場合，１０のＮ／Ｐ比率が最適であることが見出され，細胞毒性を最小化しながら十分なトランスフェクションレベルを提供する。…」(ウ) 国際公開第２００６／０８５６６４号（乙６）「本発明にいう核酸は，限定するものでないが，それが動物細胞デリバリーされたときに細胞に対して何らかの作用を及ぼしうる核酸または核酸関連物質を指す。化学構造により分類すると，所謂，オリゴまたはポリマーの範疇に入る，ＤＮＡ，ＲＮＡ及び核酸アナログ…が本発明にいう核酸に包含される。」（９頁４～１０行目）「本発明の組成物では，核酸とポリカチオン荷電性ポリマーとの混合比は，ポリマー中のカチオンと核酸分子内のリン酸基との比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。Ｎ／Ｐ比とは，次式によって定義される量であり，以後断りの無い限り，Ｎ／Ｐ比とはこの量のことを指す。 Ｎ／Ｐ比＝〔溶液中のポリマー中のカチオンの総数〕／〔溶液中の核酸中のりん酸基の総数〕本発明において，Ｎ／Ｐ比は，ポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず，ポリマーに含まれる非荷電性セグメントまたは荷電性セグメントの性質によって異なる。本発明における適当なＮ／Ｐ比は，当業者であれば，適宜選択することができる。」（１４頁１９行目～１５頁４行目）「実施例１：ＤＥＴ，ＰＥＧ－ＤＥＴを用いた培養細胞（株化細胞）- 86 -への遺伝子導入この実施例では，ＤＥＴ及びＰＥＧ－ＤＥＴの細胞への遺伝子導入能を株化細胞に対するルシフェラーゼ遺伝子導入により評価する。・・・＜結果＞図１（判決注 Ｎ／Ｐ比を１～１００まで変化させてルシフ この実施例では，ＤＥＴ及びＰＥＧ－ＤＥＴの細胞への遺伝子導入能を株化細胞に対するルシフェラーゼ遺伝子導入により評価する。・・・＜結果＞図１（判決注 Ｎ／Ｐ比を１～１００まで変化させてルシフェラーゼ遺伝子発現を観察するものである。）に示すように，いずれの細胞においても，ＤＥＴ／ｐＤＮＡｃｏｍｐｌｅｘでは，特に，Ｎ／Ｐ比１０以上で高いルシフェラーゼ遺伝子発現が確認された。 ＰＥＴ－ＤＥＴ／ｐＤＮＡｃｏｍｐｌｅｘでは，Ｎ／Ｐ比２０以上で高い遺伝子発現が観察された。…また，ＤＥＴ，ＰＥＧ－ＤＥＴともＮ／Ｐ比が８０を越える条件では発現が低下した。」（１８頁下から１１行目～２０頁９行目）「請求の範囲１．ポリカチオン荷電性ポリマーを核酸のキャリヤーとして含んでなる標的細胞または組織への核酸デリバリー用組成物であって，ポリカチオン荷電性ポリマーが，ポリ（アミノ酸），多糖，…をベースとする主鎖を有し，かつ，側鎖として…を含む荷電性ポリマー…，核酸デリバリー用組成物。」（２８頁１～１４行目）(エ) 特表２００６－５１７７９３号公報（乙７）「【請求項１】標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって，一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびＰＥＩに細胞を曝すことを含み，該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが該標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと相補的な５０未満のリボヌクレオチド領域を含み，該標的遺伝子がＲＮＡ干渉により下方制御されるものである，方法。」「【００２７】- 87 -標的遺伝子の下方制御のために必要なｓｓＲＮＡの量は，経験的に決定され得，そして当業者の技術の範囲内である。カチオンポリマーの量は使用されるｓｓＲＮＡの量に依存する。ＰＥＩについて，例えば，ＰＥＩの全窒素原子の数とｓｓＲ めに必要なｓｓＲＮＡの量は，経験的に決定され得，そして当業者の技術の範囲内である。カチオンポリマーの量は使用されるｓｓＲＮＡの量に依存する。ＰＥＩについて，例えば，ＰＥＩの全窒素原子の数とｓｓＲＮＡのリン酸基の数との比（Ｎ／Ｐ比）は，ｓｓＲＮＡの所定の量を効果的に送達するためのＰＥＩの量を決定するための好適なパラメータである。好ましい態様において，該Ｎ／Ｐ比は２～１０，さらに好ましくは３～８である。とりわけ好ましい比は５である。好ましい比は，取り込み後のエンドソームから複合体の取り込みおよび放出を可能にするために，オリゴヌクレオチドを効果的に複合体化させるのに必要な直鎖状ＰＥＩの量（すなわち窒素原子の量）である。」(オ) BindingofCationic α-HelicalPeptidestoPlasmidDNAandTheirGeneTransferAbilitiesintoCells, THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY, vol.272, p.15307-15312（平成９年）（乙８）「正の（ペプチド）／負の（ＤＮＡ）の電荷比は，それぞれ０，０． １０，０．２５，０．５０，１．０，２．０，４．０と８．０だった（図２Ａ）。」（１５３０８頁右欄末行～１５３０９頁２行目）「トランスフェクション効率における４６とプラスミドＤＮＡの量の影響は図７に示される。最高のトランスフェクション効率は，２．５μｇのプラスミドＤＮＡの量と２．６ｎｍｏｌの４６が混合された場合に生じた。さらに，どれだけの量のＤＮＡでも，ペプチド：ＤＮＡ混合比は２．０で最適化される。ペプチド：ＤＮＡ電荷比が２．０以下である場合，効率は下がった。」（１５３１１頁右欄１１～１７行目）「ペプチ じた。さらに，どれだけの量のＤＮＡでも，ペプチド：ＤＮＡ混合比は２．０で最適化される。ペプチド：ＤＮＡ電荷比が２．０以下である場合，効率は下がった。」（１５３１１頁右欄１１～１７行目）「ペプチドとプラスミドＤＮＡの最適な混合細胞は，１６－ｍｍディッシュ毎に０．６６－５．３ｎｍｏｌの４６と１．３－１０μｇのプラスミドＤＮＡからなるペプチド－ＤＮＡ複合- 88 -体の存在下で培養された。培養した後，効率が後述の実験手順で解析された。上部のボックスの数値は，電荷比（ペプチド：ＤＮＡ）を示す。」（１５３１１頁図７の説明文）(カ) StearylatedArginine-RichPeptides: ANewClassofTransfectionSystems, BioconjugateChem., vol.12, p.1005-1011（平成１３年）（乙９）「最高のルシフェラーゼ活性は，２：１のカチオン：アニオン電荷比で処理された細胞から得られた（図４Ａ）。」（１００８頁左欄２３～２５行目）「（Ａ）ステアリル化Ｒ８を用いたプラスミドＤＮＡ（ＰＧＶ－Ｃ２，２．５μｇ）でトランスフェクトされたＣＯＳ－７細胞からのルシフェラーゼ活性におけるカチオン：アニオン電荷比の影響。それぞれの棒は３つの結果の平均値を示す。今回の標準偏差はとても小さいので，誤差は図に表れていない。」（１００８頁図４（Ａ）の説明文）イ以上によると，ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を細胞に導入（トランスフェクト）するに当たり，リン酸（Ｐ）により負に帯電した核酸と塩基性アミノ酸（Ｎ）などにより正に帯電したカチオン性分子とを組み合わせて複合体とすること，その際の核酸とカチオン性分子との混合比は窒素原子の数とリン酸基の数との比（Ｎ Ｐ）により負に帯電した核酸と塩基性アミノ酸（Ｎ）などにより正に帯電したカチオン性分子とを組み合わせて複合体とすること，その際の核酸とカチオン性分子との混合比は窒素原子の数とリン酸基の数との比（Ｎ／Ｐ比）で表されるところ，Ｎ／Ｐ比がトランスフェクション効率に影響すること，そのため，核酸とカチオン性分子の組合せに応じて，Ｎ／Ｐ比を変化させて，トランスフェクション効率が高くなるＮ／Ｐ比を最適化すること，その際には，例えば前記ア(イ)ないし(カ)で示されるような０．１～１００といった幅広い数値が検討されることは，本願優先日当時の周知技術であったものと認められる。 (2) 相違点(2)の容易想到性の判断についてア Ｎ／Ｐ比について- 89 -(ア) 引用例１には，「本発明のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体は，一つのカチオン性ペプチドと複数のＲＮＡ，複数のカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡ，一つのカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡで形成される複合体を包含する。カチオン性ペプチドの長さ，配列，電荷は，ＲＮＡの長さ，配列，及び，それらの濃度と同様に，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比を決定するための関連要因である。効率的な複合体形成や導入のために，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比や濃度を最適化することは当業者にとって容易である。」の記載があり（乙１，２３頁１２～１８行目），実施例１においても，「Ｐｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比は，ＲＮＡ分子数へのペプチド分子数の割合として，分子間の電荷比によって算出される。」の記載がある（乙１，２６頁下から６～５行目）。そうすると，引用発明においても，複合体の効率的な細胞内への導入のために，カチオン性ペプチドとＲＮＡの混合比について検討する必要があるものといえる。 そして，前記(1 ，２６頁下から６～５行目）。そうすると，引用発明においても，複合体の効率的な細胞内への導入のために，カチオン性ペプチドとＲＮＡの混合比について検討する必要があるものといえる。 そして，前記(1)の周知技術を踏まえると，引用発明において，最適なトランスフェクション効率を達成するために，複合性のカチオン性ペプチドの正電荷とＲＮＡの負電荷のバランスに着目して，複合体の「１つのＲＮＡ（分子）の，１つ以上のオリゴペプチドに対する窒素／リン酸塩比（Ｎ／Ｐ比）」に着目し，これを変化させて最適化し，その値を，０．１～１００の範囲内の値である０．５～５０とすることは当業者において適宜行うことができたものと認められる。 (イ)ａ これに対し，原告は，引用例１には，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さについて一切記載がない上に，緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは，コード領域のヌクレオチドの数に依存するだけでなく，ｍＲＮＡの５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域の長さにも依存することに照らすと，引用発明の緑色蛍光タンパク- 90 -質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程度であることが本願優先日当時の技術常識であるとの本件審決の認定は誤りであり，引用例１に基づいて導き出せる事項は，せいぜい，引用発明の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さは，確実に７００塩基より極めて大きいであろうということだけにすぎないから，このような引用例１の開示事項から，本願発明の相違点(2)に係る構成が示唆されることはない旨主張する。 確かに，本件審決は，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程度であることが技術常識であることを前提に，引用発明におけるＮ／Ｐ比が１．１４である旨の認定をしているが，他方で，相違点( ，本件審決は，引用発明の緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの塩基数が７００塩基程度であることが技術常識であることを前提に，引用発明におけるＮ／Ｐ比が１．１４である旨の認定をしているが，他方で，相違点(2)の容易想到性の判断に当たり，上記のＮ／Ｐ比の値を根拠とすることなく，Ｎ／Ｐ比を最適化し０．５～５０の範囲内とすることは適宜行うことであると判断しているものであるから，上記技術常識が誤りであるかどうかは，本件審決の判断の誤りの有無に影響を及ぼすものではない。 そして，引用発明に基づき相違点(2)のＮ／Ｐ比の構成を容易に想到し得ることは，前記(ア)のとおりである。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 ｂ 原告は，トランスフェクションのしやすさは，Ｎ／Ｐ比だけでは決定されず，当然，複合体の大きさなど，様々な要素が影響し，ある複合体について，トランスフェクションの効率上好ましいとされるＮ／Ｐ比を，トランスフェクションの対象が異なるものに適用することはできないところ，前記(1)アの各文献に記載されたヌクレオチドは，引用発明のものよりも短かったり（乙７），トランスフェクトするヌクレオチドがＲＮＡでなくＤＮＡであったり（乙４，８，９）するもので，引用発明の複合体の構成要素とは異なるから，これらの文献を根- 91 -拠に引用発明から相違点(2)のＮ／Ｐ比の構成を容易に想到し得るとはいえない旨主張する。 しかしながら，前記(1)ア(イ)ないし(エ)のとおり，ＤＮＡの場合のみならずＲＮＡとカチオン性ペプチドの複合体をトランスフェクションする場合にもＮ／Ｐ比を考慮する必要があるところ，その際，前記(1)ア(イ)及び(ウ)のように，ＤＮＡとＲＮＡが同様に挙げられているように，ＤＮＡとＲＮＡは同じ核酸に属する負電荷を持つ物 ェクションする場合にもＮ／Ｐ比を考慮する必要があるところ，その際，前記(1)ア(イ)及び(ウ)のように，ＤＮＡとＲＮＡが同様に挙げられているように，ＤＮＡとＲＮＡは同じ核酸に属する負電荷を持つ物質なのであるから，ＲＮＡとカチオン性ペプチドとの混合比を検討するに当たり，ＤＮＡを対象としてカチオン性ペプチドとの混合比の指標として認識されているＮ／Ｐ比を参考にして，引用発明のようなＲＮＡとカチオン性ペプチドの混合比を適宜設定することは，当業者において十分になし得ることといえる。 また，乙７に記載されたヌクレオチドの長さが引用発明におけるものよりも短いものであるとしても，前記(1)ア(エ)のとおり，乙７も，核酸とカチオン性分子の組合せに応じてＮ／Ｐ比を変化させ，トランスフェクション効率が高くなるＮ／Ｐ比を最適化することを開示するものであって，その手法に本質的な違いがあるわけではないから，前記周知技術を認定する根拠とすることに問題はない。 よって，原告の上記主張は理由がない。 ｃ 原告は，本件審決が，本願補正発明のＮ／Ｐ比について臨界的意義が認められないとしたことにつき，引用発明では，免疫反応に関して，抗原をコードする核酸で形質転換された細胞において，コードされた抗原を発現させることが記載されているのみであるのに対し，本願補正発明は，あらゆる抗原の発現及び提示を含まない，生得の免疫反応を引き起こすことを課題として，これを解決するものであり，その効果も開示されており，このように，本願補正発明と引用発明とでは，- 92 -解決しようとする課題が異なり，得られる効果も異質であるから，引用発明に基づく本願補正発明の進歩性を判断するに際して，Ｎ／Ｐ比の値に関する臨界的意義を問題とする必要はない旨主張する - 92 -解決しようとする課題が異なり，得られる効果も異質であるから，引用発明に基づく本願補正発明の進歩性を判断するに際して，Ｎ／Ｐ比の値に関する臨界的意義を問題とする必要はない旨主張する。 しかしながら，原告の本願補正発明と引用発明との解決課題や効果が異なるとの主張に理由がないことは前記３のとおりであるから，原告の上記主張はその前提を欠き理由がない。 イモル比について(ア) ある特定の核酸とカチオン性ペプチドの複合体において，Ｎ／Ｐ比が定まればモル比も当然に定まるし，Ｎ／Ｐ比が変化すればモル比も変化するなど，Ｎ／Ｐ比とモル比とは互いに連動するものであって，両者を独立して制御することはできない。 引用例１には，「好ましい実施形態では，ＲＮＡは病原体，または，癌細胞などの新生物（腫瘍）細胞からのものである。好ましい実施形態では，抗原は腫瘍細胞または病原体からのものである。好ましくは，腫瘍細胞は腎癌の癌細胞，多発性骨髄腫細胞，慢性リンパ性白血病細胞，またはメラノーマ細胞である。好ましい病原体は，ＨＴＶおよびＨＣＶである。」の記載があるところ（前記２(1)ア(オ)），例えば，メラノーマ細胞由来の抗原であるｇｐ１００，ＭＡＲＴ－１や，乳癌細胞由来の抗原であるＭＵＣ－１などの代表的な腫瘍抗原のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡは，いずれも１０００塩基以上であり（乙１０の図６，乙１１の図１，及び乙１２の図３），これらのＲＮＡも１０００塩基以上となること，引用発明で用いられる緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡの長さも１０００塩基以上となるものが知られていること（甲４）に照らすと，ｍＲＮＡにつき，その長さが１０００塩基以上のものが想定可能であることは本願優先日当時の技術常識であるということができる。そして，ヌクレオチド１塩 上となるものが知られていること（甲４）に照らすと，ｍＲＮＡにつき，その長さが１０００塩基以上のものが想定可能であることは本願優先日当時の技術常識であるということができる。そして，ヌクレオチド１塩基につきリン酸基（Ｐ）は一つであるから，長さが１０- 93 -００塩基以上のｍＲＮＡにおけるＰの数も１０００以上となる。 また，Ｐｏｒｔ－３カチオン性ペプチドは，１分子当たり８個の塩基性アミノ酸を含むことが明らかである。 そうすると，引用発明において長さが１０００塩基以上のｍＲＮＡを採用し，Ｎ／Ｐ比として前記アの０．５～５０の値を用いて最適化をすれば，ｍＲＮＡ１分子当たりのＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドは６２． ５分子以上～６２５０分子以上（０．５×１０００÷８＝６２．５～５０×１０００÷８＝６２５０）となり，本願補正発明におけるモル比の構成を包含することになる。 以上のとおり，Ｎ／Ｐ比が変化すればモル比も変化するなど，Ｎ／Ｐ比とモル比とは互いに連動するものであること，引用発明において，Ｎ／Ｐ比として前記アの０．５～５０の値を用いれば，技術常識として知られたｍＲＮＡの長さを前提とした場合，当然にそのモル比が相違点(2)のモル比の構成を包含することになることに照らすと，引用発明においても，当業者はそのモル比を適宜選択することができたものと認められる。 (イ)ａ これに対し，原告は，引用例１には，ペプチド：ＲＮＡ複合体比が１００：１～１：１の範囲にある，つまり，ＲＮＡ分子１個当たり，最大でもペプチドは１００個以下であると明確に記載しており，これ以外に数値範囲についての記載はなく，しかも，引用発明における上記数値範囲は，本願補正発明と異なる引用例１記載の発明の目的である，細胞形質転換及び細胞サイトゾル内でのｍＲＮＡ翻訳 記載しており，これ以外に数値範囲についての記載はなく，しかも，引用発明における上記数値範囲は，本願補正発明と異なる引用例１記載の発明の目的である，細胞形質転換及び細胞サイトゾル内でのｍＲＮＡ翻訳に適合されたものであるから，単なる例示ではなく，引用発明において上記の数値範囲とする動機付けがない旨主張する。 しかしながら，前記２(1)ア(オ)のとおり，引用例１には，「本発明のカチオン性ペプチド－ＲＮＡ複合体は，一つのカチオン性ペプチド- 94 -と複数のＲＮＡ，複数のカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡ，一つのカチオン性ペプチドと一つのＲＮＡで形成される複合体を包含する。 カチオン性ペプチドの長さ，配列，電荷は，ＲＮＡの長さ，配列，及び，それらの濃度と同様に，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比を決定するための関連要因である。効率的な複合体形成や導入のために，カチオン性ペプチドとＲＮＡの比や濃度を最適化することは当業者にとって容易である。」の記載がある。 しかも，前記(1)のとおり，Ｎ／Ｐ比がトランスフェクション効率に影響し，核酸とカチオン性分子の組合せに応じて，Ｎ／Ｐ比を変化させて，トランスフェクション効率が高くなるＮ／Ｐ比を最適化すること，その際には，０．１～１００といった幅広い数値が検討されることは周知のことであったところ，前記(ア)のとおり，Ｎ／Ｐ比が変化すればモル比も変化するなど，Ｎ／Ｐ比とモル比とは互いに連動するものである。 そうすると，当業者は引用例１におけるＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比１００：１～１：１の数値範囲についても，これに限定されるものではないものと理解するものといえ，引用例１における上記数値範囲の記載は，引用発明においてこれ以外の数値を採用することの妨げとなるものということは ～１：１の数値範囲についても，これに限定されるものではないものと理解するものといえ，引用例１における上記数値範囲の記載は，引用発明においてこれ以外の数値を採用することの妨げとなるものということはできない。 また，原告は，仮に，引用発明の上記の数値範囲が単なる一例を示したものにすぎないとしても，引用例１に記載された，トランスフェクションして生成されるタンパク質抗原による免疫誘導という課題ではなく，引用例１に記載のない複合体自体がＴＬＲに結合することによる免疫活性という本願補正発明の課題を検討して初めて，相違点(2)の構成に係るモル比を想到し得るものである旨主張するが，その前提（本願補正発明と引用発明の課題や効果が全く異なるとの前提）に疑- 95 -問があるのみならず（前記ア(イ)），当業者において引用発明のモル比を適宜設定できたといえることは前記(ア)のとおりである。 したがって，原告の上記主張は理由がない。 ｂ 原告は，仮に引用例１記載の緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基長として甲４記載の１０００塩基よりわずかに大きい緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基長を用いたとしても，引用発明の複合体のＮ／Ｐ比を本願補正発明でおいて特定された０．５～５０の範囲とするためには，引用発明におけるＲＮＡとＰｏｒｔ－３カチオン性ペプチドの複合比（モル比）は，少なくとも１：６２． ５以上とならねばならず，結局，引用発明の同比１：１～１：１００のうち，１：６２．５～１：１００というわずかな範囲で実現されるのみであって，それ以外の範囲では実現されず，引用発明における緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さがより長ければ，本願補正発明において特定されたＮ／Ｐ比の範囲を満たすためのＲＮＡ１個に対するペプチドのモル比の範囲 範囲では実現されず，引用発明における緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの長さがより長ければ，本願補正発明において特定されたＮ／Ｐ比の範囲を満たすためのＲＮＡ１個に対するペプチドのモル比の範囲は更に狭くなるから，引用発明において，本願補正発明において特定されるようなＮ／Ｐ比の範囲となるようなモル比を選択するための具体的な教示があるということはできない旨主張する。 しかしながら，原告の上記主張は，引用発明におけるＰｏｒｔカチオン性ペプチドとＲＮＡの複合比（モル比）につき１００：１～１：１に限定されることを前提とするものであると解されるが，その前提が採用できないことは前記ａのとおりである。 したがって，原告の上記主張はその前提を欠き理由がない。 ｃ 原告は，引用発明におけるＲＮＡ複合体につき，ＲＮＡに対するペプチドのモル比が２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）であるようにすると，そのような重い複合体- 96 -は細胞質に到達できず，仮にイン・ビトロ等で人工的に細胞質に到達させたとしても，複合体中のＲＮＡが複合化しているペプチドに「遮蔽」されてしまい，細胞質内のリボソームがＲＮＡに翻訳可能なように結合できず，抗原が全く発現されないことが当業者において知られているから，当業者において，引用発明のＲＮＡに対するペプチドのモル比を２５０以上（かつ，本願の特許請求の範囲の請求項１に特定するＮ／Ｐ比）とすることはない旨主張する。 しかしながら，本願の優先日当時，モル比が２５０以上となるような一つのＲＮＡ分子に対して多くのペプチドが複合したＲＮＡ複合体につき，細胞質内のリボソームに到達できないとか，複合体中のＲＮＡが複合化しているペプチドに遮蔽されてしまい，細胞質内の 以上となるような一つのＲＮＡ分子に対して多くのペプチドが複合したＲＮＡ複合体につき，細胞質内のリボソームに到達できないとか，複合体中のＲＮＡが複合化しているペプチドに遮蔽されてしまい，細胞質内のリボソームがＲＮＡに翻訳可能なように結合できないとの技術的知見が存在したことを示す証拠の提出はない。 かえって，本願明細書の実施例４（段落【０２４０】）及び図８には，ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて，（Ａｒｇ）９：ｌｕｃ－ＲＮＡの質量比が１０：１～１：１（モル比が１：３８４以上）の重いＲＮＡ複合体とした場合も，ＨｅＬａ細胞においてｍＲＮＡの翻訳が行われルシフェラーゼが産生されたことが示されている。 なお，原告は，上記の本願明細書の実施例４及び図８の実験結果はイン・ビトロのものであり，イン・ビボでは発現量が低く，同様の結果は得られないことは当業者において周知であるとし，その根拠として甲１０（試験報告書）を提出するが，甲１０には試験の具体的条件等の記載もなく，これを上記の原告の主張の裏付けとすることはできない。そして，他に原告の上記主張を裏付ける証拠もない。 以上によると，原告の上記主張は理由がない。 ｄ 原告は，本件審決が，モル比を１：２５０以上とすることにつき，- 97 -臨界的意義が認められない旨判断していることに対し，前記ア(イ)ｃのＮ／Ｐ比の場合と同様の理由により，モル比の点について臨界的意義を問題とすべきでない旨主張するが，前記ア(イ)ｃと同様の理由により原告の主張は理由がない。 また，原告は，本願明細書の図７，実施例８，図１０及び図１１，実施例１１，図２１及び図２２によれば，本願補正発明は，モル比を１：２５０以上とすることにより引用発明から予測される範囲を超えた顕著な効果を奏する旨主張する。 ７，実施例８，図１０及び図１１，実施例１１，図２１及び図２２によれば，本願補正発明は，モル比を１：２５０以上とすることにより引用発明から予測される範囲を超えた顕著な効果を奏する旨主張する。 しかながら，原告の上記主張は，本願補正発明が，免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡそれ自体が非特異性の免疫反応のみを誘発するものであると認定されることを前提に，その効果について主張するものであるが，本願補正発明が，免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡそれ自体が非特異性の免疫反応を誘発する物のみに限定されるものではないことは，前記３のとおりである以上，原告の上記主張はその前提を欠き理由がない。 なお，本願明細書の実施例８，図１０及び図１１で用いられた免疫活性化複合化一本鎖ＲＮＡ（ヘプタアルギニン（（Ａｒｇ）７））は，オリゴペプチドの長さが７であり，本願補正発明の構成（ペプチドの長さが８～１５）とは異なる複合体を用いたものであるから，上記実施例等を本願補正発明の効果を裏付けるものということはできない。 ウ以上によると，引用発明においてＮ／Ｐ比及びモル比につき相違点(2)の範囲内とすることは，当業者が適宜行うことであり，そのような数値限定をすることの臨界的意義は認められないとした本件審決の判断に誤りはなく，原告主張の取消事由３は理由がない。 ５ 結論以上の次第であるから，原告主張の取消事由はいずれも理由がなく，本件審- 98 -決にこれを取り消すべき違法は認められない。 したがって，原告の請求は棄却されるべきものである。 知的財産高等裁判所第３部 裁判長裁判官鶴岡稔彦 裁判官大西勝滋 裁判官神 高等裁判所第３部 裁判長裁判官鶴岡稔彦 裁判官大西勝滋 裁判官神谷厚毅 - 99 -（別紙）明細書図面 【図７】 【図８】 - 100 -【図１０】 【図１１】 - 101 -【図２１】 【図２２】
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