平成２７年６月１１日判決言渡同日原本受領裁判所書記官平成２６年（行ケ）第１００８１号審決取消請求事件口頭弁論終結日平成２７年５月１４日判決 原告オルガノジェネシスインク． 訴訟代理人弁理士廣江武典同西尾務同服部素明同橋本哲同谷口直也同廣江政典同隅田俊隆同吉田哲基同中山公博 被告特許庁長官指定代理人郡山順同高美葉子同板谷一弘同根岸克弘 主文 １ 原告の請求を棄却する。 ２ 訴訟費用は原告の負担とする。 ３ この判決に対する上告及び上告受理申立てのための付加期間を３０日と定める。 事実及び理由 第１ 請求特許庁が不服２０１０－６１８４号事件について平成２５年１１月２０日にした審決を取り消す。 第２ 事案の概要 １ 特許庁における手続の経緯等(1) 原告は，平成１１年１１月１９日，発明の名称を「生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法」とする発明について国際特許出 第２ 事案の概要 １ 特許庁における手続の経緯等(1) 原告は，平成１１年１１月１９日，発明の名称を「生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法」とする発明について国際特許出願（ＰＣＴ／ＵＳ９９／２７５０５。パリ条約による優先権主張；平成１０年１１月１９日（以下「本願優先権主張日」という。），優先権主張国：米国。パリ条約による優先権主張：平成１１年６月２４日，優先権主張国：米国。請求項の数３０。以下「本願」という。）をし，平成１３年５月２１日に日本国国内段階への移行手続を行ったところ（特願２０００－５８２５３７。甲９)，平成２１年１１月１８日付けで拒絶査定を受けたことから，平成２２年３月２３日，これに対する不服の審判を請求した。 (2) 特許庁は，前記(1)の審判請求を不服２０１０－６１８４号事件として審理し，平成２４年７月３０日付けで拒絶理由通知をしたところ，原告から平成２５年１月３１日付け誤訳訂正書（請求項の数２５）により特許請求の範囲等の補正を受け，さらに同年３月１２日付けで拒絶理由通知をしたところ，原告から同年９月１８日付け手続補正書により特許請求の範囲等を補正する内容の補正（請求項の数２５。以下「本件補正」という。）を受けたが，同年１１月２０日，「本件審判の請求は，成り立たない。」との審決（以下「本件審決」という。）をし，その謄本は，同年１２月３日，原告に送達された（甲８，１０，１３～１６）。 (3) 原告は，平成２６年４月１日，本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。 ２ 特許請求の範囲の記載本件補正後の特許請求の範囲の請求項１の記載は，次のとおりである（甲８）。以下，この請求項１に記載された発明を「本願発明」といい，本願に係る明細書（甲１０及び甲８により訂正された甲９）を「本 載本件補正後の特許請求の範囲の請求項１の記載は，次のとおりである（甲８）。以下，この請求項１に記載された発明を「本願発明」といい，本願に係る明細書（甲１０及び甲８により訂正された甲９）を「本願明細書」という。 【請求項１】培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で成長し，前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている，線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって，前記細胞外マトリックスが，（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；（ｉｉ）デコリン；および（ｉｉｉ）グリコサミノグリカンを包含し，そして該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし，前記化学的に定義された培養培地は，（Ｉ）基礎栄養培地，（ＩＩ）インスリン，（ＩＩＩ）Ｌ－グルタミン又はＬ－グルタミン誘導体，および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み，且つ未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地であり，前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である，培養組織構築物。 ３ 本件審決の理由の要旨(1) 本件審決の理由は，別紙審決書の写しのとおりである。要するに，本願発明は，本願優先権主張日前に頒布された刊行物１（特開昭６４－１０９８３号公報。甲１）に記載された発明（以下「引用発明」という。）並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づいて当業者が容易に発明 本願発明は，本願優先権主張日前に頒布された刊行物１（特開昭６４－１０９８３号公報。甲１）に記載された発明（以下「引用発明」という。）並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない，というものである。 (2) 本件審決が認定した引用発明は，次のとおりである。 ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞をアスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディムで培養し，培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織であって，該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着しており，コラーゲン，プロコラーゲン，酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などからなる細胞外マトリックスの性状および含有割合が，動物の真皮に近似し，コラーゲンの型はα１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）が含まれている人工組織。 (3) 本願発明と引用発明との対比本件審決が認定した本願発明と引用発明との一致点及び相違点は，以下のとおりである。 ア一致点培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で成長し，前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている，線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって， 前記細胞外マトリックスが，（ｉ）原線維性コラーゲン；（ｉｉ）プロテオグリカン；および（ｉｉｉ）グリコサミノグリカンを包含し，そして該細 養組織構築物であって， 前記細胞外マトリックスが，（ｉ）原線維性コラーゲン；（ｉｉ）プロテオグリカン；および（ｉｉｉ）グリコサミノグリカンを包含し，そして該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし，前記化学的に定義された培養培地は，（Ｉ）基礎栄養培地，（ＩＩＩ）Ｌ－グルタミン又はＬ－グルタミン誘導体，および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む培地である，培養組織構築物。 イ相違点(ア) 相違点１原線維性コラーゲンが，本願発明では「（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン」であるのに対して，引用発明に含まれる「コラーゲン」の構造は不明である点。 (イ) 相違点２プロテオグリカンが，本願発明では「デコリン」であるのに対して，引用発明では「生体組織に存在する種々のプロテオグリカン」である点。 (ウ) 相違点３培養培地が，本願発明では，「化学的に定義された培養培地」であり，その成分に「（ＩＩ）インスリン」を含み，「未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地」，すなわち，「前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並 びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子」の無い培地であり，当該培地により「該細胞外マトリックス」が産生されるものであるのに対して，引用発明では，培養培地にインスリンを含んでおらず，また，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培養培地で細胞外マトリックスが産生されるものである点。 外マトリックス」が産生されるものであるのに対して，引用発明では，培養培地にインスリンを含んでおらず，また，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培養培地で細胞外マトリックスが産生されるものである点。 ４ 取消事由(1) 相違点３に係る容易想到性の判断の誤り（取消事由１）ア相違点３に係る構成の容易想到性の判断の誤り（取消事由１－(1)）イ作用効果の顕著性の認定判断の誤り（取消事由１－(2)）(2) 本件審決の手続違背（取消事由２）第３ 当事者の主張 １ 取消事由１－(1)（相違点３に係る構成の容易想到性の判断の誤り）について〔原告の主張〕(1) 本件審決は，相違点３の容易想到性について，「本願発明は，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加し，細胞外マトリックスが無血清培地で期待どおり産生されることを確かめることで，相違点３に記載の本願発明の特定事項のごとくしたものであって，細胞外マトリックスが産生されることを確かめることは，当業者が何の創作性もなくなし得る単なる確認事項にすぎない。」と認定判断したが，以下のとおり，上記認定判断は誤りである。 (2) インスリンの添加についてア本件審決は，①「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のあるインスリン」を無血清培地に添加することは周知の事項であると認定判断し，また，刊行物１（甲１）では，血清の入った培地であるが，腱線維芽細胞の培養において，インスリンを添加した培地で， 細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンの合成が盛んになることを確認しており，これに基づいて，②「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる」と認定判断し，これらに基づいて，引用発明において，無 ンの合成が盛んになることを確認しており，これに基づいて，②「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる」と認定判断し，これらに基づいて，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加する程度のことは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえると認定判断した。 イ上記①の「全ての細胞に対して成長因子として働く作用のあるインスリン」との点について刊行物Ｎ（甲７。以下，刊行物の引用については，本件審決が刊行物の引用において用いた「刊行物Ｌ～Ｎ」，「刊行物２，３」の表記を使用することがある。）の段落【００１５】，【００１８】及び【００２０】には，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を，インスリンを含む無血清培地で培養した場合に，蛋白質等の産生が認められず，細胞が死滅ないし減少していることが記載され，また，刊行物Ｌ（甲５）の５３頁右欄５～９行及び５４頁左欄９～２２行の記載から，無血清培地に添加されたインスリンは，単に線維芽細胞を維持する機能を有するにすぎず，線維芽細胞の「成長因子」として機能するものではないと理解されることからすれば，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のある」ことが周知の事項であるとした本件審決の認定判断は誤りである。 仮に，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用」があることが周知であるとしても，後記(3)ウのとおり，「線維芽細胞を培養する」ことと，「線維芽細胞を培養することにより細胞外マトリックスを産生する」こととは技術的意義が異なるから，上記周知事項が直ちに，「無血清で培養し，細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを無血清培地に添加すること」が周知であ ることにより細胞外マトリックスを産生する」こととは技術的意義が異なるから，上記周知事項が直ちに，「無血清で培養し，細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを無血清培地に添加すること」が周知であることの根拠 とはなり得ず，まして，細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを無血清培地に添加することについての動機付けとなるものではない。 ウ上記②の「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる」との点について刊行物１（甲１）の「（刊１－１０）」（７頁右下欄５行～８頁右下欄末行。以下，刊行物の引用については，本件審決が刊行物の引用に際して付した「（刊○－○）」なる符号を使用することがある。）には，ある培地で線維芽細胞を培養することにより，細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンの合成が盛んになったこと，及び当該培地中の「一成分として」インスリンが含まれていることを開示するにとどまり，インスリンがコラーゲン合成を促進した旨の記載はなく，インスリンとコラーゲン合成とを関係付ける技術的知見も存在せず，インスリンの技術的意義すら開示されていない。むしろ，刊行物１の「（刊１－７）」（５頁左下欄９行～６頁右上欄１９行）では，Ａｓ－２－Ｐ（アスコルビン酸－２－リン酸エステル）を含み，インスリンを添加していない培地においてコラーゲンが産生されたことが記載され，刊行物１の「（刊１－１０）」には，コラーゲン合成の低下が，線維芽細胞のコラーゲン合成に対するアスコルビン酸エステルの刺激作用を弱めたことに起因する旨の記載があることに鑑みれば，当業者は，コラーゲン合成を促進する成分は，インスリンではなく，Ａｓ－２－Ｐであると認識するのが自然かつ合理的である。 したがって，刊行物１の記載に基づい する旨の記載があることに鑑みれば，当業者は，コラーゲン合成を促進する成分は，インスリンではなく，Ａｓ－２－Ｐであると認識するのが自然かつ合理的である。 したがって，刊行物１の記載に基づいて，「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる」とした本件審決の認定判断は誤りである。 エ以上によれば，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のある」ことは周知の事項でないから，無血清培地で細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを添加すること についての動機付けはなく，また，仮に上記事項が周知の事項であるとしても，このことは，無血清培地で細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを添加することについての動機付けとはならない。 更に，刊行物１（甲１）には，「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されること」は記載も示唆もないから，引用発明において，無血清培地で細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを添加することは，当業者が容易になし得る程度のものではない。 したがって，「引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加する程度のことは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえる」との本件審決の前記アの認定判断は誤りである。 (3) 細胞外マトリックスの産生についてア本件審決は，①「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた」と認定判断するとともに，②「線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように古くから行われており，無血清で培養できることは技 培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた」と認定判断するとともに，②「線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった」と認定判断した上，これらに基づいて，「無血清培地で細胞外マトリックスが必ず産生されるとまでは分からないとしても，引用発明のごとく血清添加培地では細胞外マトリックスが産生されており，かつ，無血清培地でも物質生産ができるという上記技術常識に照らせば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることは明らかである」と認定判断した。 イ上記①の「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた」との点について 刊行物Ｍ（甲６）の段落【００２５】及び【０００５】には，単に「ヒト腎細胞」の培養によりプロウロキナーゼを産生したことが示されているのみであり，また，血清濃度を減少させると細胞の増殖性が著しく低下させるか死滅し，所望の細胞生成物（蛋白質等）の収量が著しく減少するなどの問題があることが示され，さらに，インスリンを含有する無血清培地が，あらゆる細胞において蛋白質等の発現を可能にする旨の記載も示唆もない。特開２００３－１９０２７３号公報（甲１８）の段落【００１４】には，線維芽細胞の培地から血清を除去すると，細胞死が誘導されることが，ＷＯ２００７／０８０９１９号再公表公報（甲１９）の段落【０００４】，【０００６】及び【０００８】には，動物細胞の培養には通常，血清が添加された培地を用いて行われ，培地中の血清濃度を低下させることにより，細胞はその増殖性を著しく低下させ 甲１９）の段落【０００４】，【０００６】及び【０００８】には，動物細胞の培養には通常，血清が添加された培地を用いて行われ，培地中の血清濃度を低下させることにより，細胞はその増殖性を著しく低下させるか又は死滅し，従来の無血清培地では，１０％血清含有培地と比較して必ずしも十分な細胞増殖効果を得るに至っていないことが，それぞれ記載されている。また，刊行物Ｎ（甲７）の段落【００１５】，【００１８】及び【００２０】は，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を，インスリンを含む無血清培地で培養しても，必ずしも血清含有培地で培養した場合と同様に蛋白質等を産生できるとは限らないことを示している。さらに，特開平８－３０８５６１号公報（甲１１）の段落【００４６】～【００４９】は，血清含有培地でアルブミンを産生する肝細胞を，インスリンを含み，亜セレン酸ナトリウムを含有しない無血清培地で培養したところ，アルブミンの産生量が低下したことを示している。 これらの記載に鑑みれば，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞であっても，無血清培地の組成によっては，目的とする物質を産生することができず，細胞が死滅又は減少することもあることは明らかである。 そのため，本願優先権主張日当時，無血清培地により蛋白質等の物質生 産を行うことは，特定の細胞及び培地に限って「可能」であるにすぎず，細胞及び培地組成を問わず，無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことが本願優先権主張日前から普通に行われているとはいえず，まして，無血清培地でも蛋白質等の物質を生産できることが技術常識であるということはできない。 したがって，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できるこ あるということはできない。 したがって，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた」とした本件審決の認定判断は誤りである。 ウ上記②の「線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった」との点について一般に，細胞の「培養」には，蛋白質等を産生させるために培養することだけでなく，単に細胞を増殖させるために培養することも含まれる。 そして，「細胞を増殖させるために培養すること」と，「蛋白質等を産生させるために培養すること」とは技術的意義が異なるから，前者が技術常識であるとしても，このことが当然に，後者が技術常識であることの根拠とはなり得ない。 そして，刊行物１（甲１）には，「種々の細胞は「分化」の過程で，コラーゲン，プロテオグリカンをはじめとする組織特異的な細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）を合成し」（１頁左下欄１５行～１７行）と記載されているから，線維芽細胞が細胞外マトリックスを産生するには，分化（細胞が形態的，機能的に特殊性を獲得していくこと）が必要である。 これに対して，刊行物Ｌ（甲５）は，ヒト線維芽細胞を無血清培養で「増殖」することについて開示するにすぎず，無血清培養における線維芽細胞の分化や細胞外マトリックスの産生についての技術的知見はない。 したがって，刊行物Ｌの「培養」は，線維芽細胞を「増殖」させることを意味するにすぎず，その結果，刊行物Ｌからは，せいぜい線維芽細胞を増殖させるために無血清で培養することが技術常識であるといえるだけで，線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させる せることを意味するにすぎず，その結果，刊行物Ｌからは，せいぜい線維芽細胞を増殖させるために無血清で培養することが技術常識であるといえるだけで，線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することが技術常識であるとはいえない。 したがって，本件審決の刊行物Ｌ（甲５）についての上記認定判断が，「線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することが技術常識である」ことを意味するのであれば，かかる認定判断は誤りである。 エ以上によれば，細胞及び培地組成を問わず無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項ではなく，無血清培地でも蛋白質等の物質を生産できることは技術常識ではないことに加え，線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することも技術常識ではないことから，引用発明において，「細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせること」はなく，本件審決の前記アの認定判断は誤りである。 オ被告の主張(2)ウについて(ア) 被告は，「線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することも技術常識ではない」としても，「アスコルビン酸リン酸エステル」を含む「引用発明のごとくの血清培地では細胞外マトリックスが産生されて」いるのだから，引用発明において，刊行物２（甲２）及び乙２に記載の周知の技術にならい，血清に代えてインスリンを添加することにより無血清培地とした場合であっても，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」の作用により細胞外マトリックスが産生されるであろうという期待を当業者に抱かせ ることは明らかである旨主張する。 血清培地とした場合であっても，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」の作用により細胞外マトリックスが産生されるであろうという期待を当業者に抱かせ ることは明らかである旨主張する。 しかし，血清培地での培養により物質産生する細胞を無血清で培養しても，当然に同様に物質産生をすることができないことは前記イのとおりであるから（甲６，７，１１），引用発明において，血清培地で細胞外マトリックスが産生されているとしても，このことが直ちに，無血清培地でも同様に，細胞外マトリックスが産生されるであろうという期待を当業者に抱かせることの根拠とはなり得ない。また，刊行物１（甲１）の実験結果は，あくまで「アスコルビン酸リン酸エステル」という特定の成分が細胞外マトリックス産生に寄与することを実証するにすぎず，それ以外の成分，例えば動物血清が細胞外マトリックス産生に寄与しないことを根拠付けるものではない。むしろ，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養した場合に否定的なことが記載されている甲６の段落【０００５】，甲１８の段落【００１４】並びに甲１９の段落【０００６】及び【０００８】の記載を考慮すれば，「アスコルビン酸リン酸エステル」を含んでいても，引用発明において，血清培地に代えて無血清培地を用いた場合には，線維芽細胞が十分に増殖・分化して細胞外マトリックスを産生することができないと認識するのが通常である。 (イ) 被告は，線維芽細胞を使用してインスリンを含有する無血清培地で蛋白質の生産を目的とする培養方法も普通に知られているから（乙２），血清の代わりとなる物質を添加した無血清培地で線維芽細胞の増殖及び蛋白質等の産生が妨げられるような技術常識も存在しない旨主張する。 しかし，乙２は血管内皮増殖 られているから（乙２），血清の代わりとなる物質を添加した無血清培地で線維芽細胞の増殖及び蛋白質等の産生が妨げられるような技術常識も存在しない旨主張する。 しかし，乙２は血管内皮増殖因子蛋白質に関するものであり，引用発明のような人工組織とは性質が大きく異なるから，「蛋白質」という極めて大枠で一致するとしても，乙２の開示内容は，培地組成も異なる 引用発明において無血清培地とした場合の細胞外マトリックス産生について予測する材料とはなり得ない。 (4) 相違点３に関する審判段階での原告の主張についてア本件審決は，無血清培地を用いる点について，刊行物１（甲１）には，「牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましい」と記載があるだけであり，好ましいとは，添加することが必須であることを意味するものではなく，また，特許請求の範囲にも血清の有無は記載されていないから，刊行物１には，血清を加えない態様も包含されると理解され，刊行物１の記載事項は，無血清培地で培養することについての阻害要因となり得ないと認定判断した。 しかし，「動物血清を添加することが好ましい」ことが，動物血清を添加することが必須であることを直ちに意味するものではないとしても，かかる記載に接した場合，特段の事情がない限り，当業者は「好ましい」態様である動物血清を添加する態様を選択するのが自然かつ合理的である。更に，前記(3)イのとおり，本願優先権主張日当時，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養しても，必ずしも蛋白質等を産生できるとは限らないことが知られている上，引用発明が血清を加えない態様を「包含する」こと自体は，何ら血清を加えない態様の技術的意義を開示ないし示唆するものではなく，しかも，刊行物１には，無血清で培 できるとは限らないことが知られている上，引用発明が血清を加えない態様を「包含する」こと自体は，何ら血清を加えない態様の技術的意義を開示ないし示唆するものではなく，しかも，刊行物１には，無血清で培養した場合の実施例の記載はなく，無血清で培養した場合にも同様に細胞外マトリックスからなる人工組織を生産することができることについての技術的説明もない。 これらの点を考慮すれば，刊行物１（甲１）の「動物血清を添加することが好ましい」ことが，動物血清を添加することが必須であることを意味するものではなく，引用発明が血清を加えない態様を「包含する」としても，そのことは，刊行物１の上記記載事項が，相違点３の構成であ る無血清培地で培養することに至ることについての阻害要因となることを否定する根拠とはなり得ない。 したがって，本件審決の上記認定判断は誤りである。 イ本件審決は，仮に，刊行物１（甲１）において血清を添加することが求められているとしても，血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２（甲２）），ロット間でばらつきがあること（刊行物３（甲３）），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍ（甲６））等の欠点があることが本願優先権主張日前から知られており，引用発明において，無血清とする強い動機があるといえる旨認定判断した。 しかし，前記(3)イのとおり，本願優先権主張日当時，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養しても，必ずしも蛋白質等を産生できるとは限らないことが知られており，まして，本願優先権主張日当時，線維芽細胞を無血清で培養して細胞外マトリックスを産生することができることは知られていない。他方，刊行物２及び３で指摘されている上記欠点は，細胞と細胞外マトリッ おり，まして，本願優先権主張日当時，線維芽細胞を無血清で培養して細胞外マトリックスを産生することができることは知られていない。他方，刊行物２及び３で指摘されている上記欠点は，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果を達成する上で支障とならず，刊行物Ｍで指摘されている上記欠点についても，無血清培地を用いる以外の技術手段により回避することが可能であるのに対し，無血清で培養した場合にはそもそも細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果を達成することができるかが不明である。 そうすると，当業者は，引用発明において，血清を用いた場合のメリットが無血清の場合のメリットよりも上であると考え，その結果，無血清培養を忌避するのが自然かつ合理的であるから，血清には各種の欠点があることが本願優先権主張日前から知られているとしても，このことは，引用発明において無血清とする強い動機付けとはなり得ない。 したがって，本件審決の上記認定判断は誤りである。 〔被告の主張〕(1) インスリンの添加についてア原告の主張(2)イについて本件審決が，「全ての細胞に対して成長因子として働く作用のある」と認定したのは，刊行物２（甲２）の段落【００２７】の記載による。また，刊行物Ｎ（甲７）の段落【０００２】及び【０００３】によれば，従来からインスリンは，無血清培地において血清に代わる物質として知られていた。また，無血清培地は，乙1（３６頁1 行～１２行）に記載のように，本願優先権主張日前から，市販されているほど当たり前のものであり，市販のものには血清代替物として大抵インシュリンが含まれている。 以上のことから，「全ての細胞」でないにせよ多くの例において，無血清培地で培養す 前から，市販されているほど当たり前のものであり，市販のものには血清代替物として大抵インシュリンが含まれている。 以上のことから，「全ての細胞」でないにせよ多くの例において，無血清培地で培養する際に血清に代わる物質としてインスリンを添加するということが周知の事項として知られていたことは明らかである。 イ原告の主張(2)ウについて本件審決が，「インスリンの添加によりコラーゲンの合成が妨げられることなく，促進される」と認定したのは，本件審決にあるとおり，刊行物１（甲１）の「（刊１－１０）」(本件審決３０頁７～１４行)の記載を根拠とするものである。したがって，本件審決は，(a)インスリンを添加した培地で，インスリン添加によりコラーゲンの合成は妨げられることがないこと，(b)As-2-P 及びインスリンを添加した培地で，コラーゲン合成が促進されたこと，の２つの事項が分かることをいうものである。本件審決の「インスリンの添加によりコラーゲンの合成が妨げられることなく，促進される」との記載は，原告が主張するような「インスリンがコラーゲンの合成を促進した」という趣旨ではない。 そして，刊行物１（甲１）の３頁右上欄３～１２行，５頁右下欄９～１２行及び７頁左上欄４～７行の記載によれば，引用発明において，コラー ゲン及び細胞外マトリックスの産生に寄与するのは引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」である。そして，刊行物１の「(刊１－１０)」に記載された「デキサメサゾン，インスリン，As-2-P，EGF および10％FCS添加ウィリアムス培地E」は，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」の一種であるAs-2-P のコラーゲンの合成作用を調べるために設計された培地であり，これを用いた実験において，「腱線維芽細胞は活発にコラー ス培地E」は，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」の一種であるAs-2-P のコラーゲンの合成作用を調べるために設計された培地であり，これを用いた実験において，「腱線維芽細胞は活発にコラーゲンを合成して」いるから「(a)インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることがな」く，「(b)As-2-P 及びインスリンを添加した培地で，コラーゲン合成が促進された」ことが理解される。 ウ前記アのとおり，無血清培地に血清に代わる物質としてインスリンを添加することが周知であり，前記イのとおり，インスリン添加によりコラーゲン合成が妨げられていないことから，「引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加する程度のことは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえる。」とした本件審決の認定判断に誤りはない。 (2) 細胞外マトリックスの産生についてア原告の主張(3)イについて刊行物Ｍ（甲６) の段落【０００５】の記載は，発明が解決しようとする課題として記載されているのであって，段落【００１１】によれば，刊行物Ｍ記載の発明は，上記課題を解決するため，インスリン，ペプトン及びトランスフェリンを含有させた無血清培地を用いることにより，蛋白質を大量に生産できることを見出したものである。ところで，刊行物Ｍ（甲６）の段落【０００５】に「血清濃度の減少によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅」することが記載されているように，血清代替物の添加がない無血清培地では，細胞の増殖性が著しく低下するか死滅することは技術常識である。それを解決するために，無血清培地に増殖因子を 添加することが要求され（乙３（２頁右下欄１３行），甲１９（７頁４０～４１行)），刊行物Ｍ（甲６）においては，請求項１に，無血清培地で細胞を 。それを解決するために，無血清培地に増殖因子を 添加することが要求され（乙３（２頁右下欄１３行），甲１９（７頁４０～４１行)），刊行物Ｍ（甲６）においては，請求項１に，無血清培地で細胞を増殖させる作用のあるインスリン等を添加することで，死滅等の課題を解決している。同様に，甲１９の段落【０００６】及び甲１８の段落【００１４】の各記載も，血清を除去するだけでは，細胞が死滅するが，血清代替物であり細胞増殖因子であるインスリンやTGF-β の添加により，細胞死を抑制できることを示している。したがって，甲６，甲１８及び甲１９の記載は，無血清培地で細胞外マトリックスを産生することの阻害事由になるものではない。 そして，刊行物Ｍ（甲６) の段落【００２１】には，線維芽細胞を含め多数の細胞も例示されているから，原告が主張するような特定の細胞及び培地に限って，「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うこと」が可能であるものではない。 刊行物Ｎ（甲７）の段落【０００３】記載のとおり，これまでに多くの文献に，様々な細胞で血清に代わる物質を用いた成功例があるからこそ，インスリンを含む血清代替物質が例示されており，また，細胞の種類や生産を目的とする物質の組み合わせにより，無血清培養する際に適切な血清の代わりとなる物質やその組み合わせが変わることは当然のことである。 原告が指摘する刊行物Ｎの段落【００１５】の記載は，ヒト結腸腺癌細胞株Caco-2 の培養において，血清の代わりとなる物質の適切な組み合わせによりスクラーゼを産生することを示しているだけであり，原告が主張するような「無血清培地により蛋白質等の物質生産を行うことは，特定の細胞及び培地に限って「可能」である」ことを示すものではなく，このことは，刊行物Ｎの段落【００１８】及び【００２０】 り，原告が主張するような「無血清培地により蛋白質等の物質生産を行うことは，特定の細胞及び培地に限って「可能」である」ことを示すものではなく，このことは，刊行物Ｎの段落【００１８】及び【００２０】記載の実験についても同様である。 甲１１の段落【００４６】～【００４９】の実施例は，肝細胞において 無血清培地でアルブミンを産生さるためには，インスリンに加えて，刊行物Ｎで血清に代わる物質として例示されている「セレン」の一種である亜セレン酸ナトリウムの組み合わせが適切であったことを示しているだけであって，上記のとおり，細胞の種類や生産を目的とする物質の組み合わせにより，無血清培養する際に適切な血清の代わりとなる物質やその組み合わせが変わることは当然のことであるから，かかる記載があるからといって，原告が主張するような「無血清培地により蛋白質等の物質生産を行うことは，特定の細胞及び培地に限って「可能」である」ことを示すものではない。 以上のとおりであるから，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることが技術常識となっていた」との本件審決の認定判断に誤りはない。 イ原告の主張(3)ウについて原告は，本件審決の刊行物Ｌ(甲５)についての認定判断が，「線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することが技術常識である」ことを意味するのであれば，それは誤りである旨主張するが，本件審決認定のとおり，刊行物Ｌは，線維芽細胞を無血清で培養できることが技術常識となっていたことを示しているだけであり，原告主張のような意味ではない。 ウ原告の主張(3)エについて細胞に蛋白質等を産生させるための無血清培地において，血清に代えてインスリンを添加することは周知の技術事項であった（刊行物Ｎ(甲７)の【請 うな意味ではない。 ウ原告の主張(3)エについて細胞に蛋白質等を産生させるための無血清培地において，血清に代えてインスリンを添加することは周知の技術事項であった（刊行物Ｎ(甲７)の【請求項１】，段落【０００１】～【０００３】及び【００１７】の記載，刊行物２(甲２)の（刊２－２）の記載，刊行物Ｍ(甲６)の(刊Ｍ－２)の記載，乙２の２頁左上欄５～９行及び１７～１９行の記載，乙４の４頁右上欄８～１４行)。このように，血清代替物であるインスリンを含む無血清培地は，分化を目的とする培養に普通に使用されるものであり，細胞を分 化，増殖させ，細胞外マトリックスを産生するアスコルビン酸リン酸エステルの作用を妨げるようなものではない。 そして，原告が主張するように「線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することも技術常識ではない」としても，「アスコルビン酸リン酸エステル」を含む「引用発明のごとくの血清培地では細胞外マトリックスが産生されて」いるのだから，引用発明において，上記周知の技術にならい，血清に代えてインスリンを添加することにより無血清培地とした場合であっても，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」の作用により細胞外マトリックスが産生されるであろうという期待を当業者に抱かせることは明らかである。 しかも，線維芽細胞を使用しインスリンを含有する無血清培地で蛋白質の生産を目的とする培養方法も，例えば，乙２（２頁左上欄５～９行及び１７～１９行）に示すように普通に知られている。血清の代わりとなる物質を添加した無血清培地で線維芽細胞の増殖及び蛋白質等の産生が妨げられるような技術常識も存在しない。 そうであるならば，細胞外マトリックスが産生されることを確認することは，調べてみないとは 質を添加した無血清培地で線維芽細胞の増殖及び蛋白質等の産生が妨げられるような技術常識も存在しない。 そうであるならば，細胞外マトリックスが産生されることを確認することは，調べてみないとはっきりしないようなことを確かめたものではなく，確実に産生されるであろうと当業者が思うような事項を単に確認しただけのことであって，何の困難性も要しない事項である。 したがって，本件審決の認定判断に誤りはない。 (3) 相違点３に関する審判段階での原告の主張についてア原告の主張(4)アについて引用発明が血清を加えない態様を包含しているといえるのであれば，そのことが，相違点３の構成，すなわち，無血清培地で培養することに至ることについての阻害要因となるわけがない。だからこそ，本件審決は，刊行物１の記載事項が阻害要因となり得ないことを述べているのである。 イ原告の主張(4)イについて血清には，本件審決の指摘する欠点があり，無血清で培養することが周知の課題となっていた。そして，無血清とすることで多大な作用効果が得られるのだから，無血清とする動機はあるのであって，「無血清培養における線維芽細胞の分化や細胞外マトリックスの産生についての技術的知見は存在」せず，「線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することも技術常識ではない」ことは，無血清にすることを諦めてしまう程の事情とはいえない。 ２ 取消事由１－(2)（作用効果の顕著性の認定判断の誤り）について〔原告の主張〕(1) 本件審決は，本願発明の効果は，刊行物１並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づき当業者が予測し得るものであって，格別顕著な効果とはいえないと認定判断した。 (2) しかし，刊行物１（甲１）の実験結果（ 決は，本願発明の効果は，刊行物１並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づき当業者が予測し得るものであって，格別顕著な効果とはいえないと認定判断した。 (2) しかし，刊行物１（甲１）の実験結果（７頁左上欄４行～７行）は，あくまで「アスコルビン酸リン酸エステル」という特定の成分が細胞外マトリックス産生に寄与することを実証するにすぎず，それ以外の成分，例えば動物血清が細胞外マトリックス産生に寄与しないことを根拠付けるものではなく，まして，無血清培地であっても，「アスコルビン酸リン酸エステル」が細胞外マトリックス産生に寄与することまで実証するものではない。刊行物１には，無血清で培養した場合の実施例の記載はなく，また，無血清で培養した場合にも同様に，細胞外マトリックスからなる人工組織を産生することができることについての技術的知見もない。その上，前記１〔原告の主張〕(3)イのとおり，本願優先権主張日当時，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養しても，必ずしも蛋白質等を産生できるとは限らないことが知られている。更に，前記１〔原告の主張〕(3)オのとおり，本件審決が認定判断した周知の技術的事項及び技術常識は，線維芽細胞を無血 清培地で培養した場合に，細胞外マトリックスが産生されることが周知であることを何ら根拠付けるものではない。 したがって，本願発明の効果は，刊行物１並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づき当業者が予測し得る程度のものではない。 (3) 本件審決は，本願明細書（甲１０及び甲８により訂正された甲９）には，他の成長因子等を加えずに，インスリンのみを基本培地に加えたような実施例は存在せず，段落【０１１９】～【０１２５】は，基礎培地に市販の無血清培地に加えられるトランスフェリン，表皮成長因子が加えられてお の成長因子等を加えずに，インスリンのみを基本培地に加えたような実施例は存在せず，段落【０１１９】～【０１２５】は，基礎培地に市販の無血清培地に加えられるトランスフェリン，表皮成長因子が加えられており，更にハイドロコーチゾンも添加されており，インスリンを単独で添加したものではないから，特定の実施例における効果にすぎないと認定判断した。 確かに，本願明細書には，他の成長因子等を加えずに，インスリンのみを基本培地に加えたような実施例は存在せず，段落【０１１９】～【０１２５】の実施例もインスリンを単独で添加したものではない。しかし，このことが直ちに，当該実施例に記載の効果が，特定の実施例における効果に限定されることの根拠とはなり得ない。その他の本願明細書の記載及び本願優先権主張日当時の技術常識から，本願明細書の段落【０１１９】～【０１２５】に記載の作用効果が，特定の実施例における効果に限定され，本願発明全般の作用効果であるとは認められない事情は存在しない。 したがって，本願明細書には，他の成長因子等を加えずに，インスリンのみを基本培地に加えたような実施例が存在しないとしても，このことは，本願発明の作用効果の顕著性・非予測性を否定する根拠とはなり得ない。 (4) 以上より，本願発明の効果は，刊行物１並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づき当業者が予測し得えない顕著な効果であるから，本願発明の作用効果についての本件審決の前記(1)の認定判断は誤りである。 〔被告の主張〕(1) 原告の主張(2)について 刊行物１(甲１)の７頁左上欄４～７行記載の実験結果をもって，細胞外マトリックス産生に寄与する物質が引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」であることは実証されている。そして，原告が主張するように「無血清で培養し ７頁左上欄４～７行記載の実験結果をもって，細胞外マトリックス産生に寄与する物質が引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」であることは実証されている。そして，原告が主張するように「無血清で培養した場合にも同様に，細胞外マトリックスからなる人工組織を産生することができることについての技術的知見」がなく，「血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養しても，必ずしも蛋白質等を産生できるとは限らないことが知られている」としても，細胞外マトリックス産生に寄与する物質が引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」であることが判明しているのだから，アスコルビン酸リン酸エステル含有の無血清培地に血清の代わりとなる物質を添加した場合でも，細胞外マトリックスが産生されることは十分に期待される。また，前記１の〔被告の主張〕(2)のとおり，血清の代わりとなる物質を添加した無血清培地で，線維芽細胞の増殖及び蛋白質等の産生が妨げられるような技術常識もないから，細胞外マトリックスが産生され得ないと予測する当業者はいない。 そして，当該期待のとおり，本願発明において細胞外マトリックスが産生されたというだけでは，当業者が予測し得ない顕著な効果とはいえない。 (2) 原告の主張(3)について原告主張に係る本件審決の認定判断部分は，原告が平成２５年９月１８日付け意見書（甲１６の３頁２７～２８行）で主張するように，「当業者は，牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましいことが記載されている刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養した場合に，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されると予測することは全くあり得ず，その結果，当業者は，刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養するこ 養した場合に，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されると予測することは全くあり得ず，その結果，当業者は，刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養することを想起することは全くあり得」ないとするなら，そのような効果が本願明細書に記載されているとはいえないことを判断したものである。 本願明細書の段落【０１１９】～【０１２５】の実施例は，インスリンとハイドロコーチゾンの両者の濃度を変化させていることから，インスリン単独による作用を観察しようとして試みられた実験ではないことは明らかである。そして，いずれの実験でも細胞外マトリックスの形成が確認されている。しかし，実施例における条件１～３の効果は，トランスフェリン及び表皮成長因子を含む基礎培地に，さらに，条件１～３の濃度でインスリンとハイドロコーチゾンを添加した培地で奏される効果であり，特に，条件３による効果は，インスリンを条件２の７５倍の３７５μg/ml 及びハイドロコーチゾンを１５倍の６μg/ml もの量添加したことで達成された効果である。本願発明は，ハイドロコーチゾンは発明特定事項になっていないし，濃度の限定もないのだから，本件審決が認定判断したとおり，上記段落に記載された効果は，特定の実施例の効果にすぎず，原告が主張する本願発明の効果は本願明細書に記載されていない。 ３ 取消事由２（本件審決の手続違背）について〔原告の主張〕相違点３の判断において，本件審決が周知技術を示すものとして引用した刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）は，いずれも本願の審査及び審判段階で示されたことがなく，本件審決で初めて示された文献である。相違点３についての以下の審理の経過に鑑みれば，原告には，刊行物Ｌ～Ｎに記載された事項及び当該事項を引用発明に適用 も本願の審査及び審判段階で示されたことがなく，本件審決で初めて示された文献である。相違点３についての以下の審理の経過に鑑みれば，原告には，刊行物Ｌ～Ｎに記載された事項及び当該事項を引用発明に適用することについて意見を述べる機会を全く与えられておらず，本件審決は，特許法１５９条２項で準用する同法５０条の規定に違反してされたものであり，当該違反は，審決の結論に影響を及ぼすものであるから，取り消されるべきである。 (1)ア特許庁審判長は，平成２４年７月３０日付けで拒絶理由を通知した（甲１３）。当該拒絶理由通知書（２１，２２頁）では，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を 含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」は，本願発明の「化学的に定義された培養培地は，未定義の動物臓器の無い培地または，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，供給細胞によって分泌されるタンパク質および因子からなる群より選択される組織抽出物」に包含されると認定判断し，相違点３を実質的に相違点として認定判断していない。 イ原告は，上記拒絶理由通知に対して，平成２５年１月３１日付け誤訳訂正書（甲１０）により，特許請求の範囲の請求項１を補正するとともに，同日付け意見書（甲１４・５頁）において，「本願発明と刊行物１発明とを対比すると，本願発明は，「化学的に定義された培養培地」は，血清等の「未定義の動物組織抽出物」を含まないのに対し，刊行物１発明の培地は，「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」，即ち，「１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）」という，「 リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」，即ち，「１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）」という，「未定義の動物組織抽出物」を含んでいる点で相違します。」と，相違点３に係る構成を相違点として主張した。 ウ特許庁審判長は平成２５年３月１２日付けで再度拒絶理由を通知した（甲１５）。当該拒絶理由通知書（２２，２５，２６頁）において，相違点３として，化学的に定義された「培養培地」が，「（ⅰⅰ）インスリンを含み」，「未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地」，すなわち，「前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子」の無い培地であるのに対して，刊行物１発明では「インスリンを含んでおらず，また，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む点」と認定した上で，相違点３についての容易想到性について，刊行物２（甲２）及び刊行物３（甲３）を引用し，「血清には，…欠点が有ることが知 られており，本願優先権主張日前から無血清培地での培養が周知の課題となっていた」から，かかる周知の課題に基づいて，引用発明において，無血清で培養すべくインスリンを添加して本願発明のごとく構成することは，当業者が何の困難性もなくなし得たことである旨判断した。 エこれに対して，原告は，平成２５年９月１８日付け意見書（甲１６）を提出し，相違点３の容易想到性について，専ら血清含有培地における課題の周知性が，相違点３の構成の容易想到性の根拠とはなり得ない旨の反論を述べた。同意見書において，原告は，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の 題の周知性が，相違点３の構成の容易想到性の根拠とはなり得ない旨の反論を述べた。同意見書において，原告は，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であること，「線維芽細胞を無血清で培養すること」が技術常識であること及びこれに基づく相違点３の構成の容易想到性についての意見は述べていない。 オしかるに，本件審決では，相違点３の容易想到性について，新たに刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用し，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であると認定し，刊行物Ｌ（甲５）を引用し，「線維芽細胞を無血清で培養すること」が技術常識であると認定し，かかる周知の事項に基づいて，引用発明において無血清で培養することは，当業者に容易であると認定判断した。 (2) 以上の経過に鑑みれば，相違点３の構成は，平成２５年１月３１日付誤訳訂正書（甲１０）により明瞭にされ，同日付け意見書（甲１４）で原告は相違点３の存在を明確に主張しているから，少なくとも審判官合議体はこの時点で相違点３の存在を認識できるはずであり，その結果，平成２５年３月１２日付けで再度拒絶理由を通知する時点で，相違点３の容易想到性に関して刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）を引用することができたはずである。そして，本件審決では，刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）を，単に当業者の技術水準を知る ためや，先行文献に記載された事項の技術的意義を明確にするなど補助的に用いたものではなく，相違点３の容易想到性を肯認する判断の核心的な引用例として用いたものであって，本件審決による前記(1)オの認定判断が「査定の理由と異なる理由」に該当することは明らかである。 いたものではなく，相違点３の容易想到性を肯認する判断の核心的な引用例として用いたものであって，本件審決による前記(1)オの認定判断が「査定の理由と異なる理由」に該当することは明らかである。 また，原告は，意見書（甲１６）では，専ら血清含有培地における課題の周知性が，相違点３の構成の容易想到性の根拠とはなり得ない旨の反論を述べただけであり，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であること，「線維芽細胞を無血清で培養すること」が技術常識であること及びこれに基づく相違点３の構成の容易想到性についての意見は述べていないから，これらを周知事項及び技術常識とした認定判断及びこれに基づく相違点３の構成の容易想到性について，原告には，実質的な防御の機会が与えられていない。 以上のような手続の経過，拒絶の理由の内容等に照らせば，刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）について，意見書提出の機会を与えなくとも手続の公正及び原告の利益を害さない等の特段の事情が存しないことは明らかである。したがって，本件審決の審判手続は，特許法１５９条２項で準用する同法５０条の規定に違反するものであり，かかる違反は，本件審決の結論に影響を及ぼすものである。 〔被告の主張〕(1) 本件審決で示した刊行物Ｌ～Ｎを根拠とする技術常識は，技術常識１「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のあるインスリンを無血清培地に添加することは周知の事項であった(例えば，刊行物２の(刊２－２)，刊行物Ｋの(刊Ｋ－１)，刊行物Ｌの(刊Ｌ－２)，刊行物Ｍの(刊Ｍ－２)及び刊行物Ｎの(刊Ｎ－１))」こと，技術常識２「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先 (刊２－２)，刊行物Ｋの(刊Ｋ－１)，刊行物Ｌの(刊Ｌ－２)，刊行物Ｍの(刊Ｍ－２)及び刊行物Ｎの(刊Ｎ－１))」こと，技術常識２「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先 権主張日前から普通に行われている周知の事項(例えば，刊行物Ｍの(刊Ｍ－２)及び刊行物Ｎの(刊Ｎ－１))であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた」こと，技術常識３「線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように，古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった」こと，の３つの技術常識である。 (2) 技術常識１について技術常識１を更に裏付けるものとして，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書で示した刊行物２及び刊行物Ｋの内容に加えて，本件審決で刊行物Ｌ～Ｎを補足したにすぎない。 (3) 技術常識２について本件審決で加えられた技術常識２は，技術常識１に加え，蛋白質等の物質生産を行う目的でもインスリンを無血清培地に添加することが技術常識であったことを補足するものである。このことは，刊行物２（甲２)の段落【０００１】に「本発明は，組換えの方法によりえられるタンパク質のような哺乳動物細胞産物の生産を支持することができる無血清培地に関する。」ことを前提として，「インスリンは…無血清培地において添加剤として用いられている」（刊２－２)と記載されているのであるから，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書を読んだ当業者であれば当然に理解できたことにすぎない。 (4) 技術常識３について技術常識３は，技術常識１が，線維芽細胞についても該当することを明確にしたものであり，そのために，本件審決で刊行物Ｌを補足したにすぎない。 本 すぎない。 (4) 技術常識３について技術常識３は，技術常識１が，線維芽細胞についても該当することを明確にしたものであり，そのために，本件審決で刊行物Ｌを補足したにすぎない。 本件審決で加えられた技術常識３は，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通 知書に記した技術常識１の一例にすぎず，新たな技術常識を示すものではない。 (5) 以上のように，本件審決で加えられた技術常識２及び技術常識３は，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書に記した技術常識１を補足するだけのものであり，しかも当業者であれば誰もが知る技術常識であるから，これらについて，再度の意見を述べる機会を与えなかったからといって，手続違背となることはない。 第４ 当裁判所の判断 １ 本願発明について(1) 本願発明に係る特許請求の範囲は，前記第２の２記載のとおりである。 本願明細書（甲１０及び甲８により訂正された甲９）の発明の詳細な説明には，次の記載がある。 「【０００１】【発明の属する技術分野】（発明の分野）本発明は，組織工学の分野にある。本発明は，細胞外マトリックスを産生する細胞を誘導する生体外での方法に向けられる。組織様特性を有するこの生きた細胞外マトリックスは，試験または臨床目的のために使用できる。 【０００２】【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】（発明の背景）組織工学の分野は，生物工学的方法を，正常な，および病理学的哺乳類組織での構造的および機能的関係を理解するライフサイエンスの概念と結びつける。組織工学の目標は，組織機能を保持，維持，または改善する生物学的置換の開発および最終使用である。したがって，組織工学を通して，実験室で生物工学的組織を設計および製造することが可能である。生物工 る。組織工学の目標は，組織機能を保持，維持，または改善する生物学的置換の開発および最終使用である。したがって，組織工学を通して，実験室で生物工学的組織を設計および製造することが可能である。生物工 学的組織としては，通常元来の哺乳類またはヒト組織と関連する細胞，および合成または外因性マトリックススカホードを挙げることができる。新たな生物工学的組織は，宿主に移殖された場合，機能性があり，そして宿主の体に恒久的に組込まれるか，または受容体宿主患者から得られる細胞によって進行的に生物再生されるに違いない。支持体構成員またはスカホードなしに等価の組織の作製で，新たな生物工学的組織を作成する上での科学的挑戦に至る。 【０００３】【課題を解決するための手段】（発明の要旨）本発明は，外因性マトリックス成分またはネットワーク支持体またはスカホード構成員の必要なしに，培養細胞および内因的に産生された細胞外マトリックス成分の生物工学的組織構築物に向けられる。したがって，本発明は，ヒト細胞，および例えば，生物工学的組織構築物が，ヒトに使用するために設計される場合，それらの細胞により産生されるヒト・マトリックス成分から全体的に有利に作製できる。 【０００４】本発明は，外因性マトリックス成分，ネットワーク支持体，またはスカホード構成員のいずれかの添加なしに，細胞外マトリックス成分を産生する，線維芽細胞のような培養物中の細胞を刺激することによって，組織構築物を産生する方法にも向けられる。 【０００５】本発明は，定義された培地システム中の細胞外マトリックス成分を産生する，線維芽細胞のような培養物中の細胞の刺激によって，および／またはウシ血清または臓器抽出物のような，未定義または非ヒト由来の生物学的成分を使用する た培地システム中の細胞外マトリックス成分を産生する，線維芽細胞のような培養物中の細胞の刺激によって，および／またはウシ血清または臓器抽出物のような，未定義または非ヒト由来の生物学的成分を使用することなし，組織構築物を産生する方法にも向けられる。 【０００７】いっそうさらに，組織構築物は，スカホード支持体の必要，または外因性細胞外マトリックス成分の添加なしに，培養細胞によって産生および自己組立される。 【０００９】本発明の組織構築物は，皮膚腫瘍または創傷のような組織または臓器欠陥を有する患者に対する移植のような医療目的のために，または安全性試験または医薬，化粧，および化学製品の確証のような生体外での組織試験または動物移植のために有用である。 （本発明の詳細な説明）これまで，最近工業化された生きた組織構築物は，完全には細胞で組立てられず，そして外因性マトリックス成分または構造または支持のための合成構成員の添加または組込みのいずれか，または両方に依るに違いない。 【００１０】ここに記述される生物工学的組織構築物は，それらの細胞が誘導される組織の元来の特性の多くを示す。それにより生成された組織構築物は，患者に移植するか，または生体外での試験のために使用しうる。 【００１９】細胞－マトリックス構築物を形成するための本発明の好ましい方法では，第一の細胞型である，細胞外マトリックス産生細胞型を，基質に蒔き，培養および誘導して，それらの周囲に組織化細胞外マトリックスを合成および分泌して，細胞－マトリックス構築物を形成する。本発明の別の好ましい方法では，細胞－マトリックス構築物の表面に，第二の細胞型の細胞を蒔き，そして培養して，二層組織構築物を形成する。より好ましい方法では，元来のヒト皮 トリックス構築物を形成する。本発明の別の好ましい方法では，細胞－マトリックス構築物の表面に，第二の細胞型の細胞を蒔き，そして培養して，二層組織構築物を形成する。より好ましい方法では，元来のヒト皮膚に類似の特性を示す十分な厚みの皮膚構築物が，ケラチノサイトのようなヒト上皮細胞が，播種され，そして，十分に分化した 層化表皮層を形成するのに十分な条件下で培養される皮膚層である，皮膚の細胞およびマトリックスの細胞－マトリックスを形成するマトリックス合成を誘導するのに十分な条件下で，ヒト皮膚の線維芽細胞のような線維芽細胞を培養することによって形成される。 【００２０】したがって，本発明の組織構築物を得る１つの方法は；（ａ）外因性細胞外マトリックス成分または構造的支持体構成員の不在下で，少なくとも１つの細胞外マトリックス産生細胞型を培養すること；および（ｂ）段階（ａ）の細胞を刺激して，細胞外マトリックス成分を合成，分泌および組織化させ，それらの細胞により合成される細胞およびマトリックスから構成される組織構築物を形成し，段階（ａ）および（ｂ）が，同時にまたは連続して行われるうることを包含する。 【００２９】本発明の培養組織構築物は，組織構築物の形成のための，網目構成員のような合成または生体吸収性構成員に依存しない。網目構成員は，織物，編物またはフェルト材料として組織化される。…【００３３】化学的に定義された培養培地の使用が好ましく，すなわち，未定義の動物臓器のない培地または，組織抽出物例えば，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，または胚抽出物，およびフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である。…診療所でこのような構築物を使用する上での利点は，偶発的動物または交雑種ウイル 出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，または胚抽出物，およびフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である。…診療所でこのような構築物を使用する上での利点は，偶発的動物または交雑種ウイルス混入および感染の関係が減少されることである。試験のシナリオで，化学的に定義された構築物の利点は，試験されるときに，未定義の成分の存在により，混乱されるべき結果の機会がないことである。 【００３４】 培養培地は，通常さらに，他の成分で補足された栄養塩基から構成される。 …多くの市販で入手可能な栄養源は，本発明の実施の上で有用である。これらとしては，ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）；最小必須培地（ＭＥＭ）；Ｍ１９９；ＲＰＭＩ１６４０；イスコフの修飾ダルベッコ培地（ＥＤＭＥＭ）のような無機塩，エネルギー源，アミノ酸，およびＢ－ビタミンを供給する市販で入手可能な栄養源が挙げられる。…【００３５】基本培地は，アミノ酸，成長因子およびホルモンのような成分で補足される。…好ましい具体例では，基本培地は，動物細胞培養で習熟者に知られている以下の成分で補足される。インシュリン，トランスフェリン，トリヨードチロニン（Ｔ３），および補足についての濃度および置換が，習熟者によって決定されうる，いずれかまたは両方のエタノールアミンおよびｏ－ホスホリル－エタノールアミン。 【００３６】インシュリンは，多重継代より長期間利点を供するグルコースおよびアミノ酸の摂取を促進するポリペプチドホルモンである。インシュリンまたはインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）の補足は，グルコースおよびアミノ酸を取込む細胞の能力の最終的枯渇，および細胞表現型の可能性のある分解がある場合に長期培養に必要である。…【００３７】トランスフェリ 様成長因子（ＩＧＦ）の補足は，グルコースおよびアミノ酸を取込む細胞の能力の最終的枯渇，および細胞表現型の可能性のある分解がある場合に長期培養に必要である。…【００３７】トランスフェリンは，鉄輸送調節のための培地内にある。…【００３８】トリヨードチロニン（Ｔ３）は，基本的成分であり，そして細胞代謝の速度を維持する培地中に含まれるチロイドホルモンの活性形態である。…【００３９】リン脂質であるエタノールアミンおよびｏ－ホスホリル－エタノールアミ ンのいずれかまたは両方を，その機能が，イノシトール経路および脂肪酸代謝での重要な前駆体であるものに添加する。血清に正常に見られる脂質の補足は，血清不含培地で必要である。…【００４０】培養期間中に，基本培地に，合成または分化を誘導するか，またはヒドロコルチゾン，セレニウムおよびＬ－グルタミンのような細胞成長を改善する他の成分をさらに補足される。 【００４１】ヒドロコルチゾンは，ケラチノサイト表現型を促進する，したがって，被膜およびケラチノサイトトランスグルタミナーゼ含有量のような分化した特徴を増強するケラチノサイト培養で見られた…。したがって，ヒドロコルチゾンは，ケラチノサイトシート状移殖片または皮膚構築物の形成でのようなこれらの特徴が，有益である例で，望ましい添加剤である。…【００４２】セレニウムを，血清不含培地に添加して，血清によって正常に供給されるセレニウムの痕跡要素を再補足する。…【００４３】アミノ酸Ｌ－グルタミンは，ある種の栄養基本に存在し，そして存在しないか，または不十分な量存在する場合に添加されうる。Ｌ－グルタミンは，グルタＭＡＸ－ＩTM（ジブコ・ビーアールエル，ニューヨーク州グランドアイラン タミンは，ある種の栄養基本に存在し，そして存在しないか，または不十分な量存在する場合に添加されうる。Ｌ－グルタミンは，グルタＭＡＸ－ＩTM（ジブコ・ビーアールエル，ニューヨーク州グランドアイランド）の商標の下販売されるもののような安定な形態で供給もされる。 …【００４４】表皮成長因子（ＥＧＦ）のような成長因子は，細胞規模拡大および播種を通して培養物の確立の助けになる培地にも添加されうる。…【００４５】 上に記述される培地は，一般に，下に規定されるとおり製造される。…【００４７】マトリックス産生細胞の培養により細胞－マトリックス層を形成するために，培地に，細胞によるマトリックス合成および沈着を促進する追加の剤を補足する。これらの補足剤は，細胞適合性があり，高度の純度に定義され，そして混入を含まない。細胞－マトリックス層を生成するのに使用される培地は，「マトリックス産生培地」と称される。 【００４８】マトリックス産生培地を作製するために，基本培地に，アスコルビン酸ナトリウム，アスコルビン酸のようなアスコルベート誘導体，またはＬ－アスコルビン酸ホスフェートマグネシウム塩ｎ－ハイドレートのようなそのいっそう化学的に安定な誘導体の内の１つを補足する。アスコルベートを添加して，沈着コラーゲン分子に対する可溶性前駆体である，プロリンの水酸化およびプロコラーゲンの分泌を促進する。アスコルベートは，Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン合成のアップレギュレーターと同様に，他の酵素後期翻訳過程のための重要なコファクターであることも示された。 【００４９】理論によって結合されることを望まない一方で，タンパク質合成に関与したアミノ酸を有する培地を補足することで，細胞にアミノ酸それら自身を生成させる必要 ーであることも示された。 【００４９】理論によって結合されることを望まない一方で，タンパク質合成に関与したアミノ酸を有する培地を補足することで，細胞にアミノ酸それら自身を生成させる必要のないことにより，細胞エネルギーを保存する。プロリンおよびグリシンの添加は，プロリンの水酸化形態，ヒドロキシプロリンと同様に，それらが，コラーゲンの構造を作る基本的アミノ酸である場合好ましい。 【００５０】必要とされない場合，マトリックス産生培地に，都合により，中性高分子を補足する。本発明の細胞－マトリックス構築物は，中性高分子なしに生 成され得るが，しかし，理論に結び付けられることを望まないで，マトリックス産生培地でのその存在は，コラーゲン過程およびサンプルの間にいっそう一定な沈着でありうる。１つの好ましい中性高分子は，マトリックス沈着コラーゲンに対して，培養細胞により産生される可溶性先駆体プロコラーゲンの生体外での過程を促進することが示されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。…【００５１】細胞産生細胞がコンフルエントであり，そして培養培地に，マトリックス合成，分泌，または組織化で支援する成分を補足する場合，細胞は，それらの細胞によって合成された細胞およびマトリックスから構成される組織構築物を形成するのを刺激するようである。 【００５２】したがって，好ましいマトリックス産生培地処方としては，ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース処方，Ｌ－グルタミンなし）および４ｍＭのＬ－グルタミンまたは等価物，５ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子，０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン，１×１０-4Ｍのｏ－ホスホリル－エタノールアミン，５μｇ／ｍｌインシュリン，５μｇ／ｍｌトランスレリン，２０ｐＭトリヨード たは等価物，５ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子，０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン，１×１０-4Ｍのｏ－ホスホリル－エタノールアミン，５μｇ／ｍｌインシュリン，５μｇ／ｍｌトランスレリン，２０ｐＭトリヨードチロニン，６．７８ｎｇ／ｍｌセレニウム，５０ｎｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸，０．２μｇ／ｍｌのＬ－プロリン，および０．１μｇ／グリシンで補足されたハムＦ－１２培地の基本的３：１混合物を包含する。産生培地のために，他の薬理学的剤を，培養物に添加して，分泌される細胞外マトリックスの特性，量，または型を変化させうる。これらの剤としては，ポリペプチド成長因子，転写因子，またはコラーゲン転写を上向きに調節する無機塩が挙げられる。ポリペプチド成長因子の例としては，形質転換成長因子β１（ＴＧＦ－β１）および組織－プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）が挙げられ，その両方は，コラーゲン 合成を上向きに調節することが知られている。…コラーゲン産生を刺激する無機塩の例は，セリウムである。…【００８６】実施例３：化学的に限定した培地中でのヒト新生児包皮繊維芽細胞によるコラーゲンマトリックスのＩｎＶｉｔｒｏ形成実施例１で述べた操作を用いてヒト新生児包皮繊維芽細胞を増殖させた。 細胞を３．０ｘ１０6 細胞／ｍｌ濃度になるように再懸濁し，６穴トレーの０．４ミクロンポアサイズの２４ｍｍ直径組織培養用挿入体に３．０ｘ１ ０6 細胞／ＴＷ（６．６ｘ１０5 細胞／ｃｍ2）の濃度で接種した。細胞はこの後新生子牛血清を除いた培地で実施例１と全く同様に培養した。特に，培地の組成は，ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ－１２培地（…）の３：１混合物，４ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ－１ＴＭ（…）および以下の添加物を含む；５ｎｇ／ｍｌ ヒトリコンビナント表皮成長因子（…），０ に，培地の組成は，ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ－１２培地（…）の３：１混合物，４ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ－１ＴＭ（…）および以下の添加物を含む；５ｎｇ／ｍｌ ヒトリコンビナント表皮成長因子（…），０．４μｇ／ｍｌハイドロコーチゾン（…），１ｘ１０-4Ｍ エタノールアミン（…），１ｘ１０-4ＭＯ－フォスフォリルエタノールアミン（…），５μｇ／ｍｌ インスリン（…），５μｇ／ｍｌ トランスフェリン（…），２０ｐＭ トリヨードサイロニン（…），６．７８ｎｇ／ｍｌ セレン（…），５０ｎｇ／ｍｌＬ－アスコルビン酸（…），０．２μｇ／ｍｌＬ－プロリン（…），０．１μｇ／ｍｌ グリシン（…），および０．０５％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（…）。…組織学的な評価で，構造体は限定培地で２％新生子牛血清存在下と同様に生育することが証明された。 【００９０】また，細胞－マトリックス構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲン，デコリン，およびグリコサミノグリカンが存在した。 【０１１９】実施例１５：化学的に限定した培地中でのヒト新生児包皮繊維芽細胞によ るコラーゲンマトリックスのＩｎＶｉｔｒｏ形成実施例１で述べた操作を用いてヒト新生児包皮繊維芽細胞を増殖させた。 細胞を３．０ｘ１０6／ｍｌ濃度になるように再懸濁し，６穴トレーの０． ４ミクロンポアサイズの２４ｍｍ直径組織培養用挿入体に３．０ｘ１０6 細胞／ＴＷ（６．６ｘ１０5 細胞／ｃｍ2）の濃度で接種した。この実施例では，細胞は全て化学的に限定した培地で培養した。 【０１２０】培地の組成は，ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ－１２培地（…）の３：１混合物，４ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ－１ＴＭ（…）および以下の添加物を含む；５ｎｇ／ｍｌ ヒトリコンビナント表 【０１２０】培地の組成は，ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ－１２培地（…）の３：１混合物，４ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ－１ＴＭ（…）および以下の添加物を含む；５ｎｇ／ｍｌ ヒトリコンビナント表皮成長因子（…），１ｘ１０－４Ｍエタノールアミン（…），１ｘ１０－４ＭＯ－フォスフォリルエタノールアミン（…），５μｇ／ｍｌ トランスフェリン（…），２０ｐＭ トリヨードサイロニン（…），６．７８ｎｇ／ｍｌ セレン（…），５０ｎｇ／ｍｌＬ－アスコルビン酸（…），０．２μｇ／ｍｌＬ－プロリン（…），および０．１μｇ／ｍｌ グリシン（…）。 【０１２１】上記基礎培地に加え，以下の条件で下記の添加物を加えた。 【０１２２】1． ５μｇ／ｍｌ インスリン（…），０．４μｇ／ｍｌ ハイドロコーチゾン（…），および０．０５％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（…）。 【０１２３】2． ５μｇ／ｍｌ インスリン（…）および０．４μｇ／ｍｌ ハイドロコーチゾン（…）。 【０１２４】3． ３７５μｇ／ｍｌ インスリン（…）および６μｇ／ｍｌ ハイドロコーチゾン（…）。 【０１２５】サンプルはホルマリンで固定しヘマトキシリンおよびエオジンで光学顕微鏡用の染色をした。組織学的な観察評価で，ＰＥＧのない条件２でもＰＥＧが存在する条件１とかなり同様なマトリックスを形成することが証明された。構造物のコラーゲン含量を生化学的に測定すると，ＰＥＧが存在する条件１では１６８．７±７．９８μｇ／ｃｍ2；ＰＥＧのない条件２では１７０．８８±９．０７μｇ／ｃｍ2，と両方でほとんど同量の値を示した。 高濃度のインスリンとハイドロコーチゾンを含む条件３では，他の２つの条件よりも早い時点でコラーゲンを含んでマトリックス 件２では１７０．８８±９．０７μｇ／ｃｍ2，と両方でほとんど同量の値を示した。 高濃度のインスリンとハイドロコーチゾンを含む条件３では，他の２つの条件よりも早い時点でコラーゲンを含んでマトリックスの発現が大きいことが示された。また，全ての条件下で細胞－マトリックス構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲン，デコリン，およびグリコサミノグリカンが存在した。本実施例の条件２の方法で作成した培養真皮構造体を…に示した。化学的に限定した培地で培養した２１日目の培養ヒト真皮繊維芽細胞から形成した細胞－マトリックス構造体の，固定，パラフィン包埋，ヘマトキシリンおよびエオジン染色した切片の写真を…に示した。多孔性の膜は構造物の下で薄い半透明のバンドのように見える。細胞は膜の表面上で生育し膜をマトリックスの中に取り込まないことが分かる。」(2) 前記第２の２の特許請求の範囲請求項１及び前記(1)によれば，本願明細書には，本願発明に関し，以下の点が開示されていることが認められる。 本願発明は，移植のような医療目的，あるいは生体外での組織試験等に用いられる組織構築物に関する（【０００１】，【０００９】，【００１０】）。 従来，工業化された生きた組織構築物は，完全には細胞で組み立てられず，外因性マトリックス成分又は構造若しくは支持のための合成構成員が組み込まれていたところ（【０００２】，【０００９】），本願発明は，培養条件の間，外因性マトリックス成分又は合成構成員を用いずに，線維芽細胞を，細胞外マトリックスの層を産生する条件下で培養することにより得られた， 前記線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている培養組織構築物である（【０００３】，【０００４】，【０００７】，【請求項１】）。また，本願発明は，基礎栄養培地，インス られた， 前記線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている培養組織構築物である（【０００３】，【０００４】，【０００７】，【請求項１】）。また，本願発明は，基礎栄養培地，インスリン，Ｌ－グルタミン又はＬ－グルタミン誘導体，及びアルコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む化学的に定義された培地を用いて培養したものであり，当該培地は，ウシ血清又は臓器抽出物のような，未定義の動物臓器又は組織抽出物を含まないものである（【０００５】，【０００７】，【請求項１】）。このような培地を用いることの利点は，偶発的動物又は交雑種ウイルス混入及び感染の関係が減少されること，並びに，未定義の成分の存在により混乱されるべき結果の機会がないことである（【００３３】）。 ２ 引用発明について(1) 刊行物１（甲１）には，次の記載がある。 ア（刊１－１）「２．特許請求の範囲（１）結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養し，結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする人工組織の製造法。 （２）請求項（１）記載の方法で得られる結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織。」（１頁左下欄４～１０行）イ（刊１－１１）「従来の技術種々の細胞は分化の過程で，コラーゲン，プロテオグリカンをはじめとする組織特異的な細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）を合成し，この合成されたＥＣＭは逆に細胞の接着性や，増殖，分化に重要な役割を果たすことが知られている。このＥＣＭ中の主成分であるコラーゲンは高等動物のタンパク質の３０％を占める。」（１頁左下欄１４行～同頁右下欄１行） ウ（刊１－２）「課題を解決するため ことが知られている。このＥＣＭ中の主成分であるコラーゲンは高等動物のタンパク質の３０％を占める。」（１頁左下欄１４行～同頁右下欄１行） ウ（刊１－２）「課題を解決するための手段上記の事情に鑑み，本発明者は，結合組織の細胞を培養することにより増殖させる方法について種々検討したところ，培地中に，アスコルビン酸に代えてアスコルビン酸リン酸エステルを添加すると該アスコルビン酸リン酸エステルは培地中において安定であり，しかも，有効な細胞増殖促進効果，細胞分化促進効果，生体組織に近い成分からなるＥＣＭの合成促進能などを有することを見い出した。 さらに本発明者は，長期間の結合組織の細胞の培養により，結合組織細胞とＥＣＭとからなるすぐれた人工組織が得られ，このためとりわけアスコルビン酸リン酸エステルの添加が非常に有効であることを見い出した。 本発明者は，これらの知見に基づいてさらに鋭意研究した結果，本発明を完成した。 すなわち，本発明は，結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養し，結合組織細胞とＥＣＭとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする人工組織の製造法，および結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養して得られる結合組織細胞とＥＣＭとからなる人工組織を提供するものである。 本発明方法において用いられる結合組織の細胞としては，たとえば線維芽細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，内皮細胞などが挙げられる。線維芽細胞としては，たとえばヒト皮膚線維芽細胞，ヒト胎児線維芽細胞，ラット皮膚線維芽細胞，鶏胚腱線維芽細胞などが挙げられる。」（３頁左上欄１８行～同頁左下欄８行）エ（刊１－３）’「本発明方法において用いられる培地とし 維芽細胞，ヒト胎児線維芽細胞，ラット皮膚線維芽細胞，鶏胚腱線維芽細胞などが挙げられる。」（３頁左上欄１８行～同頁左下欄８行）エ（刊１－３）’「本発明方法において用いられる培地としては，結合組織などの細胞の培養に用いられるものであれば，いずれでもよく，特に限定されるものでは ない。 培地の例としては，たとえば，ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム（ＤＭＥＭ）などの動物細胞培養用培地が有利に用いられる。培地には，たとえば動物血清，抗生物質などを添加するのが好ましい。動物血清としては，たとえば牛胎児血清が好ましく，通常約０．１～５０％（Ｖ／Ｖ），好ましくは約２～２０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加する。抗生物質としては，たとえばカナマイシン，ペニシリン，ストレプトマイシンなどが挙げられ，これらを通常約０．０５～１mg/ml の濃度となるように加える。」（３頁左下欄下から４行～同頁右下欄１２行）オ（刊１－４）「かくして得られる本発明の人工組織は，通常培養容器の器壁にシート状に生成する。従って，このまま有利に人工組織として使用することができ，所望によりエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）などの剥離剤を用いてシート状に分離することができる。」（４頁左下欄１２～１７行）カ（刊１－５）「コラーゲンは細胞内でまずプロコラーゲンとして合成され，その後にプロセシングを受けてコラーゲンが形成されることが知られている。さらにコラーゲンとして，現在Ｉ型からＸＩ型までの１１種があることが知られており，その分布は細胞あるいは組織特異性を示す。又，コラーゲン分子は相互に会合し，コラーゲン線維となり，他の細胞外マトリックス成分［酸性グリコサミノグリカン（ＧＡ 型までの１１種があることが知られており，その分布は細胞あるいは組織特異性を示す。又，コラーゲン分子は相互に会合し，コラーゲン線維となり，他の細胞外マトリックス成分［酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）］等と複合体を作り，ＥＣＭを形成する。」（４頁左下欄１８行～同頁右下欄６行）キ（刊１－６）「本発明の人工組織は，含まれる結合組織およびコラーゲン，プロコラーゲン，ＧＡＧなどからなるＥＣＭの性状および含有割合が，動物の真皮に 近似するものである。」（５頁右上欄１６～１９行）ク（刊１－７）「作用および実施例以下に実施例を挙げて，本発明をさらに具体的に説明する。 実施例１ ヒト皮膚線維芽細胞の初代培養とその継代：成人前腕より無菌的に約１０ｍｍ２の皮膚をメスで切りとり，抗生物質（２５０μｌのファンギゾン，５０mg/l ジヒドロストレプトマイシンおよび５０mg/l ペニシリンＧ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ－O）で洗浄後，カミソリで１ｍｍ２角に細切し培養皿に入れ，１０分間乾燥させた後，１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ－１０）を加え，３７℃で炭酸ガスふ卵器中で培養し，２～３日毎に培地交換を行い，培養皿一杯にまで増殖させた（初代培養）。以後，培養液を除き，細胞を洗浄後，トリプシン液を用いて細胞培養皿からはく離させ，適当に希釈し，新たな培養液を加えて細胞を播種する操作を繰り返した（細胞継代）。以下においては，集団倍加数が１０～３０回に至ったものを用いた。 実施例２ アスコルビン酸－２－リン酸エステル（Ａｓ－２－Ｐ）添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養における増殖促進とコラーゲン合成の促進（…）：実施例１で得られた細胞を直径３．５ｃｍ 施例２ アスコルビン酸－２－リン酸エステル（Ａｓ－２－Ｐ）添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養における増殖促進とコラーゲン合成の促進（…）：実施例１で得られた細胞を直径３．５ｃｍの培養皿（ファルコン社製，米国）に播種し，上記の培養液中に０．１－１．０ｍＭのＡｓ－２－Ｐを加え（●，○），合計３週間，３７℃で５％炭酸ガス－９５％空気中で培養した。対照として，一部の実験はＡｓ－２－Ｐを添加しなかった。培地は週に２度各濃度のＡｓ－２－Ｐを含む新鮮な培地に交換し計３週間培養を続けた。一部の実験（◇，◆）では，最初１週間，Ａｓ－２－Ｐを加えないで培養し，その後０．１ｍＭのＡｓ－２－Ｐを加えてさらに２週間培養した。３週間の培養において最後の２４時間に３Ｈ－プロリン（１０μ Ｃｉ／ｍｌ）とＡｓ－２－Ｐ（０．１ｍＭ）を含むＤＭＥＭ－１０で培養し，培養上清と細胞を一緒に合わせた。その後畑らの方法［バイオケミストリー（Biochemistry）１９，１６９（１９８０）］に従ってプロテアーゼフリーの細菌由来コラゲナーゼ［バイオケミストリー（Biochemistry）１０，９８８（１９７１）］によって分解される３Ｈ－プロリンの取込みによってコラーゲン合成速度を測定した（…）。 また，３週間の培養の後，培養上清を除去し，細胞層を１ml のトリス溶液（０．０５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．１１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７． ４）で洗った後，１ml の冷トリクロロ酢酸（１０％）を加えて細胞を集め，畑らの方法［ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J.Cell. Physiol），１２２，３３３（１９８５）］により蛍光法によりＤＮＡ含量の測定を行った（…）。 …にみられる様に，Ａｓ－２－Ｐ添加３週間培養により，最後の１日だけＡ J.Cell. Physiol），１２２，３３３（１９８５）］により蛍光法によりＤＮＡ含量の測定を行った（…）。 …にみられる様に，Ａｓ－２－Ｐ添加３週間培養により，最後の１日だけＡｓ－２－Ｐ添加培養した場合に比べ，コラーゲン合成率は２倍に上昇した。また，アスコルビン酸ナトリウム（ＡｓＮａ）添加の場合は，０． ２ｍＭ以上ではコラーゲン合成を阻害したが，Ａｓ－２－Ｐでは１ｍＭ添加でも阻害は全く認められなかった。 …にみられる様に，Ａｓ－２－Ｐ存在下３週間培養することにより，培養皿当たりのＤＮＡ量は４倍増加した。また，最後の２週間のみＡｓ－２－Ｐを添加培養するだけでもＤＮＡ量増加がみられることは，Ａｓ－２－Ｐが細胞接着の段階にだけ促進効果を及ぼしているのではなく，細胞増殖にも促進的に作用していることを示している。 同様にＡｓ－２－Ｐの効果は，健康人の皮膚組織細胞だけでなく，各種の結合組織における疾患を有する患者皮膚線維芽細胞においても，また胎児の肺の線維芽細胞においても認められた。」（５頁左下欄９行～６頁右上欄１９行） ケ（刊１－８）「実施例３ Ａｓ－２－Ｐ添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養により産生されるプロコラーゲンとコラーゲン（…）；実施例１で得られた細胞を実施例２と同じ方法で培養（ただしＡｓ－２－Ｐの濃度は０．１ｍＭを使用）し，３Ｈ－プロリンを用いた標識を行った。その後培養上清画分（Ｍ）と細胞層画分（Ｃ）を別々に集め氷上で軽く超音波破砕を行った。上記各画分について硫酸アンモニウム（１７６mg/ml）を，プロテアーゼ阻害剤（２５ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＮ－エチルマレイミド，１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド）の存在下に加え，析出した沈殿を０．５Ｍ 酸アンモニウム（１７６mg/ml）を，プロテアーゼ阻害剤（２５ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＮ－エチルマレイミド，１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド）の存在下に加え，析出した沈殿を０．５Ｍ酢酸に溶かし，その半量をとってプロテアーゼ阻害剤（５ml 中にペプスタチン，アンチペイン，ロイペプチンを各々２００μｇ含有）添加後，５ｍＭ酢酸を加えて透析し，プロコラーゲン画分とした。 残りの半分を用いて，１００μｇ／ｍｌのペプシンを加え，５℃ ６時間処理を行った。その後ｐＨを８に上げてペプシンを不活化し，ペプスタチン添加後透析し，コラーゲン画分とした。 凍結乾燥したプロコラーゲンとコラーゲンサンプルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在，または非存在下にＳＤＳ－５％ＰＡＧＥによって，畑らの方法［…］に従い分離した。…中のコラーゲンの型は次のとおりであった。α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）：α１またはα２はコラーゲンを構成するα鎖の種類を示し，Ｉ～Ｖはコラーゲンの型を示す。Ｐｒｏ，Ｐｎ，Ｐｃはプロコラーゲン，Ｐｎコラーゲン，Ｐｃコラーゲンを示す。β，γはコラーゲン２本もしくは３本のα鎖間で架橋が起った成分を示している。」（６頁右上欄末行～同頁右下欄１４行）コ（刊１－９）「さらに，Ａｓ－２－Ｐ添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞を実施例 ２～４と同様に培養し，電子顕微鏡を用いて観察したところ，粗面小胞体とゴルジ装置の発達を認め，さらに細胞の周りにＧＡＧ－タンパクの複合体であるプロテオグリカンおよびコラーゲン線維の著しい沈着が認められた。 また，細胞増殖促進とＥＣＭの発達に基くと思われる細胞の多層化が明瞭であった。 実施例２～４にみられたＡｓ－２－Ｐ添加培養によるヒ およびコラーゲン線維の著しい沈着が認められた。 また，細胞増殖促進とＥＣＭの発達に基くと思われる細胞の多層化が明瞭であった。 実施例２～４にみられたＡｓ－２－Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，細胞層へのコラーゲンと生体組織に多く存在する種類のプロテオグリカンの合成，蓄積と沈着およびこれらを裏付ける電子顕微鏡的観察の結果は，すべて皮膚線維芽細胞の培養においてＡｓ－２－Ｐが添加されることにより生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを示すものである。」（７頁左下欄６行～同頁右下欄４行）サ（刊１－１０）「また以下に示すとおり，結合組織の細胞を肝細胞など皮膚以外の臓器細胞とコカルチャーすることにより，生体組織に類似する組織を製造することができる。 実施例５細胞の分離と培養：肝細胞はジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー，１２２，３３３（１９８５）に記載された二段階灌流法によってウィスター雄性ラット（体重：２３０－２７０ｇ）から分離した。細胞（２．５×１０５）を直径３５－ｍｍプラスティク培養皿（約１０ｃｍ２）またはあらかじめ線維芽細胞を培養した培養皿に蒔き，１０％ＦＣＳ，インスリン１０－６Ｍ，デキサメサゾン１０－５Ｍ，Ａｓ－２－Ｐ ２×１０－４Ｍ，Ｎ－２－ヒドロ キシエチル－ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸 １０－２Ｍ，フンギゾン（０．２５mg/l），ペニシリン（５０mg/l），ストレプトマイシン（５０mg/l）を添加したウィリアムス培地Ｅ中，５％ＣＯ２／９５％空気存在下３７℃で培養した。培地は播種後 ０－２Ｍ，フンギゾン（０．２５mg/l），ペニシリン（５０mg/l），ストレプトマイシン（５０mg/l）を添加したウィリアムス培地Ｅ中，５％ＣＯ２／９５％空気存在下３７℃で培養した。培地は播種後１日目および２日目に交換し，その後１週間に２度交換した。また培地交換時にＥＧＦ（２０ng/ml）を加えた。…培養中の肝細胞と線維芽細胞の代謝活性：２日間デキサメサゾン，インスリン，Ａｓ－２－Ｐ，ＥＧＦおよび１０％ＦＣＳ添加ウィリアムス培地Ｅで培養した肝細胞はアルブミンと少量ではあるが有意な量のコラーゲン（全蛋白質量の０．３２±０．０２％：…）を産生した。３０日間の培養により，２日間培養時の５０％のＤＮＡおよび６０％のアルブミンが保持された（…）。細胞による全蛋白質の合成は減少したが，コラーゲンの合成は増加した（…）。従って，３０日間の培養による全蛋白質合成に対するコラーゲン合成の相対速度は８倍に増加し，２．５８±０．０４％となった。 同じ条件下で培養した腱線維芽細胞は活発にコラーゲンを合成し，２日間の添加物含有ウィリアムス培地Ｅ中での培養により，全蛋白質合成に対するコラーゲン合成の相対速度は，６．１４±０．１０％であった。４週間に亘る培養中，細胞の増殖は良好であった。各培養皿におけるコラーゲン合成（…）および全蛋白質合成はその時増加したが，３０日間の培養による相対速度は３．９５±０．１１％に低下した。３０日後のコラーゲン合成速度の低下は，線維芽細胞のコラーゲン合成に対するアスコルビン酸エステルの刺激作用を弱めるＥＧＦが培養中に存在したためと思われる。 肝細胞と線維芽細胞を２日間コカルチャーするとＤＮＡ含量から調べた細胞数は，二種の細胞を独立して培養した時の合計細胞数と同数であった。 全細胞数はコカルチ が培養中に存在したためと思われる。 肝細胞と線維芽細胞を２日間コカルチャーするとＤＮＡ含量から調べた細胞数は，二種の細胞を独立して培養した時の合計細胞数と同数であった。 全細胞数はコカルチャーにおいて高かったが，コラーゲン感受性放射活性 により調べた各培養皿あたりのコラーゲン合成は，線維芽細胞の単独培養時に比べ低かった。線維芽細胞はアルブミンを全く産生しなかったが，アルブミンの生産量は，肝細胞の単独培養時に比べ，コカルチャー時に高かった（…）。この事実は二種の細胞間の代謝相互作用の存在を示している。 ３０日間の培養により，細胞数およびコラーゲン合成は増加するが，線維芽細胞単独３０日間培養時に比べて低かった。アルブミン量は２日間培養時の７５％であったが，依然として肝細胞をプラスティク皿で培養して得られた最大値よりも高かった（…）。この事実もまた肝細胞と線維芽細胞との間の相互作用の存在を示している。」（７頁右下欄５行～８頁右下欄末行）(2) そして，刊行物１には，前記第２の３(2)記載のとおり，次の引用発明が記載されていることは，当事者間に争いがない。 ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞をアスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム（判決注：ＤＭＥＭ）で培養し，培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織であって，該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着しており，コラーゲン，プロコラーゲン，酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などからなる細胞外マトリックスの性状および 該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着しており，コラーゲン，プロコラーゲン，酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などからなる細胞外マトリックスの性状および含有割合が，動物の真皮に近似し，コラーゲンの型はα１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）が含まれている人工組織。 (3) なお，引用発明におけるアスコルビン酸リン酸エステルは，ヒト線維芽細胞の培養における増殖促進と，コラーゲン等からなる生体組織に近い成分からなるＥＣＭ（細胞外マトリックス成分）の合成促進能を有するものであ ると認められる（刊行物１（甲１）の３頁右上欄３～７行（刊１－２），実施例２（刊１－７））。 ３ 取消事由１－(1)（相違点３に係る構成の容易想到性の判断の誤り）について(1) 本願優先権主張日（平成１０年１１月１９日）当時の培養培地における血清の役割と問題点に関する技術的知見についてア本願優先権主張日当時の培養培地における血清の役割と問題点について，証拠（甲２，３，６，７）には，概ね，以下の各記載がある。 (ア) 刊行物２（特開平６－１５３９３１号公報。甲２）「【０００３】細胞を培養するためには，培養培地に血清を添加することが必要である。血清は，たいていの生物学的に活性な産物の生産のためだけでなく，すべての細胞系の生長のための全般な栄養物として働く。 血清には，ホルモン，成長因子，キャリアータンパク質，接着および伸展因子，栄養物，微量元素などが含まれている。培養培地には，通常約１０％以下の動物血清，たとえば牛胎児血清（ＦＢＳ）が含まれている。 【０００４】広く使われてはいるが，血清には多くの制約がある。血清には高濃度でおびただしいタンパク質が含まれており，それに １０％以下の動物血清，たとえば牛胎児血清（ＦＢＳ）が含まれている。 【０００４】広く使われてはいるが，血清には多くの制約がある。血清には高濃度でおびただしいタンパク質が含まれており，それによって，細胞の生産する少量の所望のタンパク質が劇的に妨げられる。工程の後の方でこれらの血清タンパク質を生産物から分けることが必要で，このことが工程を複雑にし，コストを増加させる。別の制約は，バッチ間での血清の不一致のために生産物中の種々の血清タンパク質汚染について重大な制約の懸念が生じることである。…【０００６】ＦＢＳなどの動物の血清を用いることのさらなる欠点は，需要の増加により供給が不安定となり，価格の上昇変動が起こることである。 【０００７】したがって，細胞の生長および生物学的に活性な産物の生 産を支持するための代替の培地補助剤の開発が強く望まれている。」(イ) 刊行物３（特開平７－１７８号公報。甲３）「【０００２】【従来の技術】従来，動物細胞の培養には牛胎仔血清添加培地が使用されてきたが，当該培地は高価であり，且つロット間のばらつきがあることから，血清を使用しない無血清培地の利用が増加しつつある。」(ウ) 刊行物Ｍ（特開平９－２５２７６７号公報。甲６）「【０００３】従来，動物細胞を生育（増殖）させる際の培地としては，極めて多種の培地，例えば，ＤＭＥＭ培地…，Ｆ１２培地…およびＲＰＭＩ１６４０培地…等が使用されてきた。しかし，これらの培地を使用して動物細胞を生育（増殖）させるには，培地に血清を加えなければならない。このため，一般には，ウシ胎児，ウマまたはヒト等の血清を１～１５％程度の濃度で使用しなければならなかった。 【０００４】しかし，血清含有培地を使用する際には 培地に血清を加えなければならない。このため，一般には，ウシ胎児，ウマまたはヒト等の血清を１～１５％程度の濃度で使用しなければならなかった。 【０００４】しかし，血清含有培地を使用する際には以下の様な問題があった。 ① 血清自体が高価なためコスト高となる。 ② 血清にはロット差があり，再現性のある培養には不利である。 ③ 産生物の培養上清からの精製が困難となる。 ④ ウイルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがある。 【０００５】このような現状に鑑みて，培地中の血清濃度を減少させる方法が検討されている。しかし，血清濃度の減少によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅し，所望の細胞生成物（例えば，蛋白質）の収量が著しく減少するなどの問題があり，培地中の血清濃度の減少は困難であった。 【０００６】このような理由から，血清を含まず，細胞が増殖性を失わずに培養される無血清培地に対して多大な関心が持たれている。 【００１６】基本培地としては，一般的に用いられる基礎培地が挙げられ，すなわち通常動物細胞が同化しうる炭素源，消化しうる窒素源および無機塩等を含有させたものが用いられ，また，必要に応じて微量栄養促進物質，前駆物質などの微量有効物質を配合してもよい。かかる基礎培地としては，細胞培養のためのすべての公知培地を使用することができ，例えば前述のＤＭＥＭ培地，Ｆ１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が例示され，特にＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。」(エ) 刊行物Ｎ（特開平７－２５５４７０号公報。甲７）「【０００２】【従来の技術】近年，動物細胞の培養技術が発達するにつれて，動物細胞の生産する生理活性物質を医薬品として応用することが期待されている。また生体か ４７０号公報。甲７）「【０００２】【従来の技術】近年，動物細胞の培養技術が発達するにつれて，動物細胞の生産する生理活性物質を医薬品として応用することが期待されている。また生体から細胞を採取し，この細胞を培養し，細胞の生産する物質を研究することが活発に行われるようになってきた。通常，動物細胞の培養にあたっては，アミノ酸，糖，無機塩，ビタミン類を含有する基礎培地に，ウシ胎児血清を添加した培地が用いられている。この培地を通常は，血清添加培地とよぶ。血清は，成長促進因子，ホルモン，脂質の供給源であり，通常の細胞培養には必須である。しかし，血清中には種々の蛋白質や未知の成分が含まれており，物質の生産にあたっては，これらの成分と目的とする蛋白質や，生理活性物質を分離精製することが困難な場合がしばしば発生する。また細胞培養に供する血清は，家畜のなかでも特に，胎児や幼体から採取したものが望ましいとされているが，動物愛護の面からも問題提起されている。 【０００３】このため，物質生産を目的とした細胞培養においては，血清を添加しない無血清培地を使用することが多かった。…」イ前記アによれば，一般に，アミノ酸，糖，無機塩，ビタミン類等を含有させた基礎栄養培地（基本培地；例えば，ＤＭＥＭ，Ｆ－１２，ＲＰＭＩ １６４０）に，血清を添加した血清含有培地を用いて，動物細胞を培養し，当該細胞を増殖させたり，あるいは，当該細胞に生物学的に活性な物質を産生させることが従来から広く行われていたが，他方において，血清には，様々な物質が含まれており生物学的に活性な産生物の培養上清からの精製の工程が複雑であること，ロット差があり再現性のある培養には不利であること，ウイルスやマイコプラズマの汚染源となること等の様々な問題点があることか れており生物学的に活性な産生物の培養上清からの精製の工程が複雑であること，ロット差があり再現性のある培養には不利であること，ウイルスやマイコプラズマの汚染源となること等の様々な問題点があることから，本願優先権主張日当時には，動物細胞の培養培地を，血清含有培地ではなく，血清を含有しない無血清培地を使用することもよく行われている周知の技術であったことが認められる。 (2) 本願優先権主張日当時の無血清培地に添加される成分に関する技術的知見についてア本願優先権主張日当時の無血清培地に添加される成分について，証拠（甲２，５，６，７，乙１，２，４，甲１１）には，概ね，以下の各記載がある。 (ア) 刊行物２（特開平６－１５３９３１号公報。甲２）ａ 刊行物２には，概ね，次の記載がある。 「【請求項１】基本培地ならびに（ａ）細胞バイアビリティ保護剤，（ｂ）インスリンおよび（ｃ）トロンビンもしくはトロンビンレセプター活性化因子のいずれかを含んでなる哺乳動物細胞のための無血清培地。」「【００２１】本発明の無血清培地は，哺乳動物細胞の生物学的に活性な産物の生産を血清入りのものに匹敵する程度に支持する。 【００２７】インスリンはすべての種類の細胞に対して成長因子として働くことが知られており，いくつかの無血清培地において添加剤として用いられている。 【００５２】実施例４：生長因子の機能的寄与 インスリンもトロンビンもいずれもＣＨＯ（判決注：チャイニーズハムスター卵巣）細胞の生長を刺激する。いずれもどちらかをＡＤＣ－１（判決注：細胞バイアビリティ保護剤）含有培地に添加すると細胞生長は同程度となる…。しかしながら，インスリンのみ存在下でのＩＬ－６生産はきわめて低く，一方トロン 激する。いずれもどちらかをＡＤＣ－１（判決注：細胞バイアビリティ保護剤）含有培地に添加すると細胞生長は同程度となる…。しかしながら，インスリンのみ存在下でのＩＬ－６生産はきわめて低く，一方トロンビンは有意に生産レベルを刺激した…。ウェル中での短期間の実験においては…，トロンビンのみを用いた生産能は，インスリンとトロンビンの両方をＡＤＣに添加したばあいにごくわずか増大したにすぎなかった。しかしながらスピナー（１００ｍｌ）中で生産をモニターすると，初期にインスリン添加でも無添加でも同等であったＩＬ－６レベルが，インスリン非存在下では９日ののちに明らかに減少した…。これらの結果よりインスリンが最適な長期間の生産に必須であることが示唆された。」ｂ 前記ａによれば，刊行物２には，基本培地に，細胞バイアビリティ保護剤，インスリン及びトロンビンを加えた無血清培地を用いて，ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞からＩＬ－６を長期間産生させることができ，トロンビンがＩＬ－６の産生を刺激し，インスリンは最適な長期間のＩＬ－６産生に必須であることが記載されているということができる。 (イ) 刊行物Ｌ（抗酸菌病研究所雑誌，第３９巻第１号，１９８７，５３～５９頁，昭和６２年７月１５日発行。甲５）ａ 刊行物Ｌには，概ね，次の記載がある。 「WI-38 細胞を含むヒト正常２倍体線維芽細胞は，インシュリン，トランスフェリン，デキサメサゾンを加えたＭＣＤＢ－１０４培養液に，ＰＤＧＦ，ＦＧＦ，brainＦＧＦ（acidic ＦＧＦ），又はＥＧＦを加えると著しく増殖する。」（５３頁の要旨１～３行） 「ＩＩ．ヒト線維芽細胞の無血清培養II-1 WI-38 細胞 dic ＦＧＦ），又はＥＧＦを加えると著しく増殖する。」（５３頁の要旨１～３行） 「ＩＩ．ヒト線維芽細胞の無血清培養II-1 WI-38 細胞WI-38 細胞は,WistarInstitute (Philadelphia)で, 1965 年に培養樹立されたヒト胎児肺由来線維芽細胞である.この細胞の低血清下のコロニー形成に有効なMCDB-104 培地を無血清培養用の培地に用いた．インシュリン(5μｇ/ml)，トランスフェリン(1μg/ml)，デキサメサゾン(55 ng/ml)が，この細胞の維持に有効であることがわかり，これらを加えた培養液を，MCDB-ITD とした。…は，MCDB-ITD に種々の成長因子を加え, WI-38 細胞の増殖をみたものである．EGF の他,FGF やPDGF もこの細胞の増殖を著しく促進することが認められた．」（５４頁左欄９～２２行）ｂ 前記ａによれば，刊行物Ｌには，MCDB-104 培地に，インシュリン，トランスフェリン及びデキサメサゾンを加えた無血清培地は，WI-38細胞（ヒト胎児肺由来線維芽細胞）の維持に有効であり，EGF やFGF等の成長因子を添加すると，この細胞の増殖が著しく促進されることが記載されているということができる。 (ウ) 刊行物Ｍ（特開平９－２５２７６７号公報。甲６）ａ 刊行物Ｍには，概ね次の記載がある。 「【請求項１】インスリン，ペプトンおよびトランスフェリンを含有することを特徴とする無血清培地。」「【００１１】【課題を解決するための手段】本発明者らは，上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果，インスリン，ペプトンおよびトランスフェリンを含有させた とする無血清培地。」「【００１１】【課題を解決するための手段】本発明者らは，上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果，インスリン，ペプトンおよびトランスフェリンを含有させた培地を用いることにより，細胞を十分に増殖させることができ，かつ細胞の順化工程がなくとも細胞が生育でき，アルブミンを含まないために蛋白質の分離精製が容易にできること，またこ の無血清培地を用いることにより蛋白質を大量に生産できることを見出して本発明を完成した。 【００２１】本発明の無血清培地で培養可能な動物細胞としては，その細胞自体が蛋白質発現可能なものでも，遺伝子工学により形質転換され異種蛋白を発現するものであってもよい。細胞自体が蛋白質を発現するものとして，例えば，…ＩＦＮ－βを産生する線維芽細胞，…等が例示される。…【００２４】実施例１（１）無血清培地の作製基本培地としてＲＰＭＩ１６４０培地…１０．２ｇを用い，添加物としてインスリン１ｍｇ，ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ，トランスフェリン１０ｍｇ，ヒポキサンチン１３ｍｇ，チミジン４ｍｇ，α－トコフェロール０．１３ｍｇおよびセレン４μｇを用いて無血清培地１Ｌを作製した。 【００２５】（２）ヒト腎細胞の培養ヒト腎細胞をマイクロキャリアビーズに付着させたものを（１）の無血清培地中に…添加した。３７℃，５％二酸化炭素の条件で培養したところ，２日間で培養液中に０．６～２．５Ｖ／ｍｌ相当のプロウロキナーゼの産生が確認できた。その後，２～３日毎に培養液を交換し，長期間（少なくとも１ケ月以上）の連続培養が可能であった。」ｂ 前記ａによれば，刊行物Ｍには，基本培地に，インスリン，ペプトン及びトランスフェリンを添加した無血清培地を用いて， 養液を交換し，長期間（少なくとも１ケ月以上）の連続培養が可能であった。」ｂ 前記ａによれば，刊行物Ｍには，基本培地に，インスリン，ペプトン及びトランスフェリンを添加した無血清培地を用いて，ヒト腎細胞を培養するとプロウロキナーゼの産生が確認され，長期培養が可能であったことが記載され，この無血清培地で培養可能な細胞の例として，ＩＮＦ－βを産生する線維芽細胞が挙げられているということができる。 (エ) 刊行物Ｎ（特開平７－２５５４７０号公報。甲７）ａ 刊行物Ｎには，概ね，次の記載がある。 「【請求項１】ガングリオシドを含有し，細胞分化を誘導することを特徴とする無血清培地。」「【０００３】このため，物質生産を目的とした細胞培養においては，血清を添加しない無血清培地を使用することが多かった。血清に代わる物質としては，増殖・成熟因子，トランスフェリンやラクトフェリンなどの蛋白質，脂溶性ビタミン類などの栄養物質，セレンやクロムなどを含む微量金属原子，インシュリンやステロイドホルモンを含むホルモン類，フィブロネクチンやラミニンあるいはレクチン類を含む細胞接着因子などを種々組み合わせて使用される。これらの成分を含有する無血清培地については，これまでに多くの文献が開示されているが，村上浩紀編集による細胞制御工学（学窓社，昭和６１年６月２０日刊）に詳しく開示されている。また特開平３─２２９７２号公報には，このような知見に基づいた細胞成長因子，ホルモン，脂質，接着因子を配合した細胞培養用培地が開示されている。 【０００４】しかし，正常な組織から分離した細胞（正常細胞）や株化していない細胞などの培養にこうした無血清培地を用いた場合，無血清培地が目的とする本来無限に増殖する細胞ではないために，細胞が産 【０００４】しかし，正常な組織から分離した細胞（正常細胞）や株化していない細胞などの培養にこうした無血清培地を用いた場合，無血清培地が目的とする本来無限に増殖する細胞ではないために，細胞が産生する生理活性物質を生産できないばかりか，良好な細胞の成育が得られないことが多かった。また，株化細胞においても無血清培地で培養できるものは限られており，通常の細胞の場合でも，血清濃度のより低い培地で順次継代培養して，血清が少なくても成育できる細胞だけを選択したり，細胞を低濃度血清に馴化させることによって，無血清培養が可能となるようにしている。しかしながら，選択や馴化の過程で本来もつ特性（生理活性物質の産生能など）が消失してしま う場合が多く，こうした無血清培地で増殖または維持できる変異株を得る操作は物質生産上好ましくなかった。また，生体内の生理代謝機能を研究するうえで，正常細胞をinvitro で培養するモデル系が求められているが，従来の無血清培地は株化した増殖細胞のために開発されたものであるために，正常な細胞の生理代謝の研究には適していない。そこで，生体から採取した正常組織由来の正常細胞が用いられているが，こうした細胞は無血清培養がほとんど不可能であった。 【００１０】ガングリオシド以外の成分としては，必須アミノ酸などを含む基礎培地成分に，さらに通常の株化細胞の培養に必要と考えられる有効成分を添加してもよい。たとえば，栄養成分としてピルビン酸ナトリウム，L-グルタミン酸ナトリウム，エタノールアミン，各種ビタミン類（例：x100 Vitamins ，FlowLaboratory 社），亜セレン酸，グルコース，フラクトースなどが添加できる。また，ホルモンとしてインシュリンやトランスフェリンを添加してもよい。 【０ Vitamins ，FlowLaboratory 社），亜セレン酸，グルコース，フラクトースなどが添加できる。また，ホルモンとしてインシュリンやトランスフェリンを添加してもよい。 【００１３】【実施例１】…【００１５】…ヒト結腸腺癌細胞株Caco-2 をインシュリン（１０μｇ／ｍｌ）およびトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）を含む上記ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。この際，シャーレを４群にわけ，…シャーレＤには何も添加しなかった。…この特の細胞の生育状態を観察したところＤ群では細胞が死滅していた（判決注：Ｄ群は，インシュリンとトランスフェリンを含む。）。一方，ガングリオシド添加群（判決注：インシュリン，トランスフェリン及びガングリオシドを含む）では細胞が生育しており，特にＧＭ３添加群では血清の添加群と同様の細胞生育状態が観察された。 【００１７】 【実施例２】本実施例においては，市販の培養液にガングリオシドを添加した培養液で細胞を培養した例を示す。培地中濃度がＧM3２μg/ml となるように，市販されている代表的な培地で増殖因子としてインシュリンとトランスフェリンを添加した無血清培地であるCosmedium ００１（コスモバイオ）に添加した。…ヒト結腸腺癌細胞株Caco-2 を培養し，…比較した。…これは市販の培地では生体の組織内環境を再現できないことによると考えられる。しかし，本発明培養液を用いた場合には，分化誘導を引き出すことができることから，本発明による培地は生体内の環境を反映しているものと考えられた。 また本発明培地は，生体中で起こる細胞分化をinvitro で再現することを可能とすることが判明した。 【００１８】【実施例３】本実施例においては，ヒトから いるものと考えられた。 また本発明培地は，生体中で起こる細胞分化をinvitro で再現することを可能とすることが判明した。 【００１８】【実施例３】本実施例においては，ヒトから分離したリンパ球の初代培養例と物質生産に及ぼす効果を示す。…リンパ球を１０ml のＰＢＳに分散して洗浄した後，150 ×ｇで10 分間遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した後，上に記載したインシュリン（10μg/ml）およびトランスフェリン（５μg/ml）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地９ml を添加し，３ml ずつシャーレ３枚（Ａ；Ｂ；Ｃ）に分注した。 シャーレＡにはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を０．３ml 添加し，シャーレＢにはＧM3３μg を添加した。７日後に培養液中のＩｇＡ含量を測定したところ，シャーレＡとＢではＩｇＡが検出されたが，シャーレＣではＩｇＡが検出されないどころか，リンパ球が死滅していた。リンパ球の培養においては，本発明は，血清含有培地の代替が可能であることが確認できた。 【００２０】【実施例４】本実施例においては，ACTH とサイクリックAMP の作用 で副腎皮質ホルモン…を分泌することが知られているマウス副腎皮質腫瘍由来細胞株Ｙ１細胞の培養例を示す。…このＹ１細胞を，インシュリン（10μg/ml）およびトランスフェリン（５μｇ/ml ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地でシャーレ３枚を使い培養した。シャーレＡにはＦＣＳ（10% ）＋ＡＣＴＨ（10 mU ）＋サイクリックＡＭＰ（１mM），シャーレＢにはＧM3（10μg/ml）＋ＡＣＴＨ（10 mU ）＋サイクリックＡＭＰ（１mM），シャーレＣにはＡＣＴＨ（10 mU ）＋サイクリックＡＭＰ（１mM）だけを添加した。…吸光度と蛋白質量から単位蛋白質重量あた μg/ml）＋ＡＣＴＨ（10 mU ）＋サイクリックＡＭＰ（１mM），シャーレＣにはＡＣＴＨ（10 mU ）＋サイクリックＡＭＰ（１mM）だけを添加した。…吸光度と蛋白質量から単位蛋白質重量あたりのステロイド量を計算したところ，血清添加培地とＧM3 添加培地で培養したＹ１のみ，ステロイドを産生していた。細胞の生育状態を観察したところＡ及びＢのシャーレでは順調に生育していることが確認されたが，Ｃのシャーレでは生細胞数が減少していることが観察された。」ｂ 前記ａによれば，ガングリオシドは細胞分化を誘導することができることから，インシュリン及びトランスフェリンを含有する無血清培地にガングリオシドを加えると，ヒト結腸腺癌細胞株Caco－２，ヒトリンパ球（初代培養），マウス副腎皮質腫瘍由来細胞株Y1 において，細胞分化を確認したり，ＩｇＡやステロイドの産生を誘導することができるが，ガングリオシドを加えない場合には，当該細胞が死滅したり，細胞数が減少することが記載されているということができる。 (オ) 乙１（三井洋司監訳「動物細胞培養の実際」３５，３６頁，平成２年２月２８日発行）ａ 乙１には，概ね，次の記載がある。 「２ 哺乳動物細胞の培養のための無血清培地作成に向けて…最後に，実験者はその細胞の培養が最終的に何を目的としているの かを明確にしなくてはならない．一般に，培養細胞はその由来組織を反映し，由来組織の基本的な特性を有し，その組織が発現するような分化や増殖の特性を示すであろう．このような目的がある細胞によって達成できる場合もある一方で，現在の組織培養法では限界のある場合もあることを認識することは重要である．培養細胞が増殖と分化・機能発現とを同時に行わない可能性もある．」（章の表題 的がある細胞によって達成できる場合もある一方で，現在の組織培養法では限界のある場合もあることを認識することは重要である．培養細胞が増殖と分化・機能発現とを同時に行わない可能性もある．」（章の表題，３４頁下から７～２行）「２・５ 至適な哺乳動物細胞培養のための市販培地哺乳動物細胞の最適な培養のために種々の会社が販売している培地には大別して以下の３種類がある…（ｉ）血清補充物…（ii）血清代替物細胞は血清代替物を加えた基本培地（たとえばRPMI-1640/ＤＭＥ１：１混合培地）中で増殖できる。この血清代替物はたいていインシュリン，トランスフェリン，増殖因子（ほとんどがＥＧＦ，ＦＧＦ，ＰＤＧＦ），ホルモン（たいていハイドロコルチゾンまたはデキサメタゾン，Ｔ３，プロゲステロン）である。…(iii) 無血清培地細胞はこの培地(DME-F12 1:1)で血清を添加せずに増殖できる。この培地には一般に，インシュリン，トランスフェリン，セレン…を含む，製品は，ＨＢ１０１，…BM-86(Wissler)。」（３５，３６頁）ｂ 前記ａによれば，乙１には，培養細胞が増殖と分化・機能発現とを同時に行わない可能性もあること，及び市販の無血清培地には血清代替成分として，インシュリンをはじめトランスフェリン等の様々な成分が含まれていることが記載されているということができる。 (カ) 乙２（特開昭６２－５６４２８号公報）ａ 乙２には，概ね，次の記載がある。 「本発明は…ヒト二倍体線維芽細胞を無血清培地で培養し，培養上清液をアフィニティークロマトグラフィー処理を含む精製工程で精製することを特徴とする血管内皮細胞増殖因子蛋白質の製造法を提供するものである。…ヒト二倍体線維芽細胞の 細胞を無血清培地で培養し，培養上清液をアフィニティークロマトグラフィー処理を含む精製工程で精製することを特徴とする血管内皮細胞増殖因子蛋白質の製造法を提供するものである。…ヒト二倍体線維芽細胞の培養に用いられる培地としてはたとえばインスリンおよびマウス表皮細胞増殖因子を含む無血清培地があげられる。…特に好ましい培地としてはたとえば…無血清培地RITC80-7［組成：第２表参照」などがあげられる。…第２表構成成分 ……グリシン…セリン…3，3’，5-トリヨードチロニンマウス表皮細胞増殖因子（判決注：マウスＥＧＦ）トランスフェリンインスリン…イーグル変法基礎培地 」（１頁右下欄下から２行～３頁左上欄１９行）「実施例１ ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清液の調製ヒト二倍体線維芽細胞を１０％胎児牛血清を含むイーグル変法培地で培養し，培養細胞がサブコンフルエンスに達した時点で，この培地を除去し，無血清培地ＲＩＴＣ８０－７を加えて４８～９６時間培養した。… 実施例２ ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＥＬ）の産生するｆ-ＥＣＧＦ蛋白質の分離精製実施例１に記載した如く，ＨＥＬを無血清培地ＲＩＴＣ８０－７で２～３日間培養した培養上清液（ＳＦＣＭ）を出発材料とした。…以上の分離精製操作の結果，ｆ-ＥＣＧＦ蛋白質は…回収率３６％，約６２００倍に精製された。」（４頁右上欄下から２行～５頁左上欄１行）ｂ 前記ａによれば，乙２には，ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＥＬ）をインシュリン，トランスフェリン，セレン等を添加した無血清培地で培養すると，血管内細胞増 ４頁右上欄下から２行～５頁左上欄１行）ｂ 前記ａによれば，乙２には，ヒト二倍体線維芽細胞（ＨＥＬ）をインシュリン，トランスフェリン，セレン等を添加した無血清培地で培養すると，血管内細胞増殖因子が産生されたことが記載されているということができる。 (キ) 乙４（特開平３－７２８７２号公報）ａ 乙４には，概ね，次の記載がある。 「ＭＣＤＢ１０７培地と，インシュリン及びトランスフェリンより選ばれた少なくとも一種の化合物とからなる無血清培地。」（特許請求の範囲第１項）「本発明において使用されるＭＣＤＢ１０７培地は公知の培地であり，従来から基礎培地として使用されているＦ１２培地を基にして，セレンを含む１０種類の微量金属を添加し，ヘペス緩衝剤を用いてより安定な緩衝系培地としたものである。」（３頁右上欄１３～１９行）「本発明の無血清培地は，哺乳類細胞，特に心筋細胞の培養の基礎培地として優れているＭＣＤＢ１０７培地と，細胞のＤＮＡ合成及び蛋白合成を促進する作用を有するインシュリン及び／又はトランスフェリンとからなるので，血清成分を含有しなくとも，哺乳類細胞を長期間安定に培養することができる。…従って，本発明の無血清培地及びそれを用いた哺乳類細胞の培養法 によれば，未知成分を含有する血清成分を全く使用しておらず，成分既知物質からなる無血清培地のため，ＤＮＡ合成，増殖に関与する因子，また収縮など分化に関与する因子の発見，固定が容易に試験できるという効果を奏する。」（４頁左上欄下から３行～右上欄１４行）「試験例２ラット新生児心筋細胞の無血清培地による培養フィブロネクチンで処理された２４－ウェルカルチュア－プレートに８×１０４個のラット新生児心筋細胞を播 欄１４行）「試験例２ラット新生児心筋細胞の無血清培地による培養フィブロネクチンで処理された２４－ウェルカルチュア－プレートに８×１０４個のラット新生児心筋細胞を播種した。この際，ＭＣＤＢ１０７培地にインシュリン（１０μｇ/ｍｌ）とトランスフェリン（１０μｇ/ｍｌ）を添加した培地を用いた。……２４時間後の付着細胞率は７８％であった。４～５日目にかけて約２４％の細胞数の増加がみられた。この培地で最大１８日間細胞数の減少もなく長期間培養できた。細胞の生存率は１８日間，常に９０％以上の高い値を示した。」（５頁左下欄下から４行～右下欄１３行）ｂ 前記ａによれば，乙４には，ＭＣＤＢ－１０７培地に，インシュリン又はトランスフェリンを添加した無血清培地を用いると，ラット新生児心筋細胞の長期間培養が可能であったことが記載されているということができる。 (ク) 甲１１（特開平８－３０８５６１号公報）ａ 甲１１には，概ね，次の記載がある。 「【請求項１】培地にセレン化合物を含むことを特徴とする動物細胞培養用無血清培地。 【請求項１２】前記培地にさらに細胞機能促進剤を含むことを特徴とする請求項１～１１のいずれかに記載の動物細胞培養用無血清培地。 【請求項１３】前記細胞機能促進剤がグルココルチコイドまたはインスリンであることを特徴とする請求項１２に記載の動物細胞培養用無 血清培地。」「【００４６】（実施例２）血清培地との比較Ａ.細胞培養容器の作製…【００４７】Ｂ.無血清培地の調整培地としてＬ－１５に，インスリン…，ＥＧＦ…，ＤＭＳＯ…，デキサメタゾン…プロリン…を加えたものに，さらにそれそれぞれ亜セレン酸ナトリウ 作製…【００４７】Ｂ.無血清培地の調整培地としてＬ－１５に，インスリン…，ＥＧＦ…，ＤＭＳＯ…，デキサメタゾン…プロリン…を加えたものに，さらにそれそれぞれ亜セレン酸ナトリウムを…添加したものを調整し，…比較用の無血清培地として亜セレン酸ナトリウムを添加していない培地を，血清培地として亜セレン酸ナトリウムの代わりに１０％の牛胎児血清を添加した培地を使用した。 【００４８】Ｃ．肝細胞の培養上記の方法で作製した細胞培養容器と無血清培地を用いて，次に示す細胞培養実験を行った。…【００４９】その結果は，…に示す通りである。…一方，亜セレン酸ナトリウム不含培地（判決注：インスリンを含む無血清培地である。）では長期培養ができていない事が確認された。この結果，亜セレン酸を含有する無血清培地で細胞機能の長期維持が可能であることがわかった。」ｂ 前記ａによれば，甲１１には，Ｌ－１５培地に，亜セレン酸ナトリウムに加え，インスリン，ＥＧＦ等を添加した無血清培地を用いると，ラット幹細胞の長期間の培養が可能であったが，当該無血清培地から亜セレン酸ナトリウムを除くと，長期間の培養はできなかったことが記載されているということができる。 イ前記アによれば，多数の文献において，インスリンを含む無血清培地を用いて，動物細胞を培養し，細胞の維持又は細胞数の増加（刊行物Ｌ （甲５），乙４，甲１１）や生物学的に活性な物質の産生を行ったことが記載され（刊行物２（甲２），刊行物Ｍ（甲６），刊行物Ｎ（甲７），乙２），線維芽細胞の培養もインスリンを含有する無血清培地が用いられており（刊行物Ｌ（甲５），乙２），実際に，インスリンをはじめトランスフェリンやセレン等の様々な成分を添加した無血清培地が市販されて ２），線維芽細胞の培養もインスリンを含有する無血清培地が用いられており（刊行物Ｌ（甲５），乙２），実際に，インスリンをはじめトランスフェリンやセレン等の様々な成分を添加した無血清培地が市販されていた（刊行物Ｎ（甲７）の【００１７】，乙１等）ことから，本願優先権主張日当時，無血清培地において，血清を代替する成分の一つとしてインスリンが汎用されていたことが認められる。 一方，インスリンを含む無血清培地を用いても，ヒト結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ－２又はヒトから分離したリンパ球が死滅したり，マウス副腎皮質腫瘍由来細胞株Ｙ１細胞の生細胞数が減少すること（刊行物Ｎ（甲７）），あるいは，肝細胞の長期培養ができないこと（甲１１）等が報告されており，血清を代替する成分としてインスリンさえ添加すれば，どのような動物細胞であっても必ず培養できるものではなく，また，乙１に「培養細胞が増殖と分化・機能発現とを同時に行わない可能性もある.」（３４頁下から３～２行）と記載されているように，培養細胞を培養した際に，増殖が生じたとしても，同時に，生物学的に活性な物質の産生のような分化・機能発現も生じるとは限らないことも，この技術分野においては広く知られており，刊行物２（甲２）には，ＡＤＣ－１（細胞バイアビリティ保護剤）とインスリンを含む基本培地（ＤＭＥＭ）では，ＣＨＯ細胞の生長は刺激されるが，トロンビン添加時には産生されていたＩＬ－６の産生は極めて低くなることが記載されている。 (3) 相違点３に係る構成の容易想到性についてそこで，本願発明と引用発明との相違点３に係る構成の容易想到性について検討する。 前記(1)のとおり，本願優先権主張日当時，細胞を培養して，細胞を増殖 させたり生物学的に活性な物質を産生させるに当たり，従 明との相違点３に係る構成の容易想到性について検討する。 前記(1)のとおり，本願優先権主張日当時，細胞を培養して，細胞を増殖 させたり生物学的に活性な物質を産生させるに当たり，従来から血清含有培地を用いることが広く行われていたとともに，血清含有培地の問題点を克服するために，血清を含有しない無血清培地を使用することもよく行われていた周知の技術であって，当業者は，細胞を培養する目的及び使途等に応じて，血清培地と無血清培地のいずれを用いるかを選択できるということは周知の事項であったということができる。 ところで，刊行物１（甲１）には，アスコルビン酸リン酸エステルが，細胞分化促進効果やコラーゲン等の細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）の合成促進能を有していることから（刊１－２），ヒト皮膚線維芽細胞等の結合組織細胞を「アスコルビン酸リン酸エステル含有培地」で培養することにより，結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織を形成せしめることが記載されている（刊１－１）。そして，刊行物１の実施例２～４においては，牛胎児血清を含む培地を用いているものの，「培地には，たとえば動物血清，抗生物質などを添加するのが好ましい。」（刊１－３）’と記載されていることから，刊行物１の記載に接した当業者は，細胞外マトリックスの産生には，アスコルビン酸リン酸エステルは必須ではあるが，血清は必須とはされておらず，血清を添加しなかったからといって細胞外マトリックスが産生されないとは直ちには認識しないものであると認められる。 そうすると，引用発明の人工組織を得るにあたり，アスコルビン酸リン酸エステルと共に牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（基礎栄養培地；基本培地）に代えて，細胞外マトリックスの産生に必須であるアスコルビン酸リン酸エステ と，引用発明の人工組織を得るにあたり，アスコルビン酸リン酸エステルと共に牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（基礎栄養培地；基本培地）に代えて，細胞外マトリックスの産生に必須であるアスコルビン酸リン酸エステルは含むこととする一方で，添加することが好ましい成分ではあるものの必須の成分とはされていない「牛胎児血清」を含まない無血清培地を用いることも，当業者であれば，細胞を培養する目的及び使途等に応じて，選択して試みるものであるということができる。 そして，前記(2)のとおり，本願優先権主張日当時，無血清培地において， 血清を代替する成分の一つとしてインスリンが汎用されており，動物細胞の増殖だけでなく，ＣＨＯ細胞からのＩＬ－６の産生（刊行物２（甲２）），ヒト腎細胞からのプロウロキナーゼの産生（刊行物Ｍ（甲６）），ヒト二倍体線維芽細胞からの血管内皮細胞増殖因子の産生（乙２）等のように，線維芽細胞等の様々な動物細胞において，インスリンを含む無血清培地での生理学的に活性な物質の産生が可能となっていた。 したがって，上記の周知の技術に基づき，無血清培地を用いて引用発明の人工組織を得るにあたり，適切な血清代替成分を添加すれば，牛胎児血清が存在する場合と同様に細胞外マトリックスが産生されることを期待することができ，その血清代替成分として，汎用されているインスリンを選択し，アスコルビン酸リン酸エステル及びインスリンを含むＤＭＥＭを用いることは，当業者が容易に想到し得たことというべきである。 (4) 原告の主張についてア原告は，刊行物１（甲１）の「動物血清を添加することが好ましい」との記載が，動物血清を添加することが必須であることを意味するものではなく，引用発明が血清を加えない態様を「包含する」としても，そのことは，刊行物１ １（甲１）の「動物血清を添加することが好ましい」との記載が，動物血清を添加することが必須であることを意味するものではなく，引用発明が血清を加えない態様を「包含する」としても，そのことは，刊行物１の上記記載事項が，相違点３の構成である無血清培地で培養することに至ることについての阻害要因となることを否定する根拠とはなり得ない旨主張する。 しかし，刊行物１（甲１）の上記記載は，血清を加えない態様を排除するものではなく，血清培地とするか無血清培地とするかは，当業者が，細胞を培養する目的及び使途等に応じて選択し得る技術である以上，同記載が，無血清培地で培養することの阻害要因となるものではないことは明らかであって，原告の上記主張は失当である。 イ原告は，刊行物２及び３で指摘されている欠点は，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果を達成する上で支障と ならず，刊行物Ｍで指摘されている欠点についても，無血清培地を用いる以外の技術手段により回避することが可能であるのに対し，本願優先権主張日当時，線維芽細胞を無血清で培養して細胞外マトリックスを産生することができることは知られておらず，無血清で培養した場合にはそもそも細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果を達成することができるかが不明であるから，当業者は，血清を用いた場合のメリットが無血清の場合のメリットよりも上であると考え，その結果，無血清培養を忌避するのが極めて自然かつ合理的であり，血清には各種の欠点があることが知られているとしても，このことは，引用発明において無血清とする強い動機付けとはなり得ない旨主張する。 しかし，前記(1)イで認定した，血清には，ロット差があり再現性のある培養には不利であることや，ウイルス も，このことは，引用発明において無血清とする強い動機付けとはなり得ない旨主張する。 しかし，前記(1)イで認定した，血清には，ロット差があり再現性のある培養には不利であることや，ウイルスやマイコプラズマの汚染源となること等の問題点をどのような技術で回避可能であるのかについて原告は何ら具体的な説明をしていないから，「刊行物Ｍで指摘されている欠点についても，無血清培地を用いる以外の技術手段により回避することが可能である」との原告の主張には根拠がない。 また，無血清で培養した場合には，線維芽細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果を達成することができるとの確信が事前に得られなくとも，適切な血清代替成分を添加すれば，当該技術的結果を期待することができることは，既に説示したとおりである。 そうすると，当業者が，血清を用いた場合のメリットが無血清の場合のメリットよりも上であると考え，その結果，無血清培養を忌避するのが極めて自然かつ合理的であるとする原告の主張にも根拠がない。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 ウ原告は，刊行物Ｎ（甲７）には，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を，インスリンを含む無血清培地で培養した場合に，蛋白質等の産生が 認められず，細胞が死滅ないし減少していることが記載され，刊行物Ｌ（甲５）には，無血清培地に添加されたインスリンは，単に線維芽細胞を維持する機能を有するにすぎず，線維芽細胞の「成長因子」として機能するものではないことが記載されていることからすれば，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のある」ことが周知の事項であるとした本件審決の認定判断は誤りであり，仮に，「インスリン」が「無 ていることからすれば，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のある」ことが周知の事項であるとした本件審決の認定判断は誤りであり，仮に，「インスリン」が「無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用」があることが周知であるとしても，「線維芽細胞を培養する」ことと，「線維芽細胞を培養することにより細胞外マトリックスを産生する」こととは技術的意義が異なるから，細胞外マトリックスを産生する際，インスリンを無血清培地に添加することについての動機付けとなるものではない旨主張する。 しかし，前記(2)のとおり，本願優先権主張日当時，無血清培地において，血清を代替する成分の一つとしてインスリンが汎用されていたものと認められるから，刊行物Ｎ（甲７）や刊行物Ｌ（甲５）に記載されているように，インスリンが成長因子として作用せず，そのため，インスリンが「全ての細胞」に対して成長因子として働く作用があるとまでは認められないにしても，「無血清で培養する際，…インスリンを無血清培地に添加することは周知の事項であった」との本件審決の認定部分に誤りはない。 そして，引用発明において無血清培地で細胞外マトリックスを産生することを試みるに当たり，周知の成分の中から適切な血清代替物を選択することは当然であるから，汎用されているインスリンを添加することについての動機付けは十分に存在するというべきである。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 エ原告は，細胞及び培地組成を問わず無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項では なく，無血清培地でも蛋白質等の物質を生産できることは技術常識ではないことに加え，線維芽細胞を分化さ 蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項では なく，無血清培地でも蛋白質等の物質を生産できることは技術常識ではないことに加え，線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することも技術常識ではないことから，引用発明において，「細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせること」はないのであって，本件審決が，「無血清培地で細胞外マトリックスが必ず産生されるとまでは分からないとしても，引用発明のごとく血清添加培地では細胞外マトリックスが産生されており，かつ，無血清培地でも物質生産ができるという上記技術常識に照らせば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることは明らかである」との認定判断は誤りである旨主張する。 確かに，前記(2)において検討したところによれば，細胞及び培地組成を問わず，無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことができることが技術常識であったとはいえないとしても，ＣＨＯ細胞からのＩＬ－６の産生（刊行物２（甲２）），ヒト腎細胞からのプロウロキナーゼの産生（刊行物Ｍ（甲６）），ヒト二倍体線維芽細胞からの血管内皮細胞増殖因子の産生（乙２）等のように，様々な細胞において無血清培地での蛋白質等の物質産生が可能とされており，上記の物質産生がされた無血清培地においては血清代替物として汎用の成分であるインスリンが含まれている。 また，前記(3)のとおり，刊行物１の記載に接した当業者は，細胞外マトリックスの産生には，アスコルビン酸リン酸エステルは必須ではあるが，血清は必須とはされておらず，血清を添加しなかったからといって細胞外マトリックスが産生されないとは直ちには認識しないと認められる。 クスの産生には，アスコルビン酸リン酸エステルは必須ではあるが，血清は必須とはされておらず，血清を添加しなかったからといって細胞外マトリックスが産生されないとは直ちには認識しないと認められる。 そうすると，細胞及び培地組成を問わず，無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うことができること，あるいは，線維芽細胞を分化させて細胞外マトリックスを産生させるために無血清で培養することが，いずれも技術常識でないとしても，刊行物１の記載に接した当業者であれば，引用発明 において，アスコルビン酸リン酸エステルが存在していれば，牛胎児血清が適切な血清代替物に置換されるならば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を抱くことは，極めて自然なことといえる。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 オ原告は，刊行物１（甲１）の実験結果は，「アスコルビン酸リン酸エステル」という特定の成分が細胞外マトリックス産生に寄与することを実証するにすぎず，それ以外の成分，例えば動物血清が細胞外マトリックス産生に寄与しないことを根拠付けるものではなく，むしろ，血清含有培地で蛋白質等を産生する細胞を無血清培地で培養した場合に否定的なことが記載されている甲６の段落【０００５】，甲１８の段落【００１４】並びに甲１９の段落【０００６】及び【０００８】の記載を考慮すれば，「アスコルビン酸リン酸エステル」を含んでいても，引用発明において，血清培地に代えて無血清培地を用いた場合には，線維芽細胞が十分に増殖・分化して細胞外マトリックスを産生することができないと認識するのが通常である旨主張する。 しかし，刊行物１（甲１）に，動物血清が細胞外マトリックス産生に寄与することが記載ないし示唆されているわけではなく，刊行物Ｍ（甲６） することができないと認識するのが通常である旨主張する。 しかし，刊行物１（甲１）に，動物血清が細胞外マトリックス産生に寄与することが記載ないし示唆されているわけではなく，刊行物Ｍ（甲６）の段落【０００５】及び甲１８の段落【００１４】の記載は，血清濃度を減少又は血清を除去した場合の問題点を指摘するだけであるから，これらの記載から，直ちに，引用発明において，血清代替成分を添加した無血清培地に変更した場合に細胞外マトリックスを産生することができなくなることにつながるものではない。 また，甲１９は本願優先権主張日（平成１０年１１月１９日）よりも７年以上も後の日（平成１８年１月１３日）を優先日とする特許出願であるから，その記載事項を，本願優先権主張日当時の技術常識として考慮することは相当ではない。 そうすると，原告が指摘する上記の点を考慮しても，引用発明において，血清代替成分を添加した無血清培地を用いた場合には細胞外マトリックスを産生することができないとまで，当業者が認識するということはできない。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 カ原告は，乙２は血管内皮増殖因子蛋白質に関するものであり，引用発明のような人工組織とは性質が大きく異なるから，「蛋白質」という極めて大枠で一致するとしても，乙２の開示内容は，培地組成も異なる引用発明において無血清培地とした場合の細胞外マトリックス産生について予測する材料とはなり得ない旨主張する。 しかし，細胞外マトリックスが，血管内皮増殖因子とは性質が大きく異なるからといって，乙２の開示内容から，引用発明において，無血清培地とした場合に，細胞外マトリックスが産生されることがあり得ないと予測するような事情は特に見出すことができない。 子とは性質が大きく異なるからといって，乙２の開示内容から，引用発明において，無血清培地とした場合に，細胞外マトリックスが産生されることがあり得ないと予測するような事情は特に見出すことができない。そして，細胞外マトリックスが産生されるとの確信が得られないことは，引用発明において，牛胎児血清に代えて，血清代替成分として汎用されているインスリンを添加した無血清培地を用いることを阻害するものではなく，そのような無血清培地を用いることを当業者が容易に想到し得ることは，既に説示したとおりである。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 キ原告は，刊行物１（甲１）の（刊１－１０）は，一成分としてインスリンが含まれているある培地で線維芽細胞を培養することにより，細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンの合成が盛んになったことを開示するに留まり，コラーゲン合成を促進する成分はインスリンではなく，Ａｓ－２－Ｐであると認識するのが自然かつ合理的であるから，本件審決が「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進される ことが分かる」とした認定判断は誤りである旨主張する。 しかし，本件審決の上記認定判断が，「インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，Ａｓ－２－Ｐによりコラーゲン合成が促進されることが分かる」との趣旨であることは，前記２の刊行物１の記載からみて明らかであるから，原告の上記主張は採用することができない。 (5) 小括以上によれば，相違点３に係る本願発明の構成は，当業者であれば，引用発明から容易に想到し得たものということができるから，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告主張の取消事由１－(1)は理由がない。 ４ 取消事由１－(2) 明の構成は，当業者であれば，引用発明から容易に想到し得たものということができるから，この点に関する本件審決の判断に誤りはなく，原告主張の取消事由１－(1)は理由がない。 ４ 取消事由１－(2)（作用効果の顕著性の認定判断の誤り）について(1) 原告は，本願発明の効果は，刊行物１並びに周知技術の技術的事項及び技術常識に基づき，当業者が予測し得ない顕著な効果であるから，本件審決が，本願発明の効果は格別顕著な効果とはいえないとした認定判断は誤りである旨主張する。 しかし，前記３で説示したとおり，引用発明において，無血清で培養した場合にも，同様に細胞外マトリックスが産生されるという確証が事前に存在しなくとも，周知の課題に基づき，無血清培地を用いて引用発明の人工組織を得るにあたり，適切な血清代替成分を添加すれば，牛胎児血清が存在する場合と同様に細胞外マトリックスが産生されることを，当業者は期待するということができる。 そして，本願発明において，そのような当業者の期待どおりに，血清代替成分として汎用されているインスリンを含有する実施例で用いられた無血清培地を用いた際に，細胞外マトリックスが産生され人工組織が得られたことは，当業者の予測し得ない格別顕著な効果ということはできない。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 (2) 原告は，本件審決が，無血清培地で細胞外マトリックスが産生される効 果は，基礎培地に市販の無血清培地に加えられるトランスフェリン，表皮成長因子が加えられており，更にハイドロコーチゾンも添加されており，インスリンを単独で添加したものではないから，特定の実施例における効果にすぎない旨認定判断したことについて，本願明細書の記載及び本願優先権主張日当時の技術常識から，本 ロコーチゾンも添加されており，インスリンを単独で添加したものではないから，特定の実施例における効果にすぎない旨認定判断したことについて，本願明細書の記載及び本願優先権主張日当時の技術常識から，本願明細書の段落【０１１９】～【０１２５】に記載の作用効果が，特定の実施例における効果に限定され，本願発明全般の作用効果であるとは認められない事情は存在しないから，他の成長因子等を加えずに，インスリンのみを基本培地に加えたような実施例が存在しないとしても，このことは，本願発明の作用効果の顕著性・非予測性を否定する根拠とはなり得ず，本件審決の上記認定判断は誤りである旨主張する。 しかし，本願明細書の「基本培地は，アミノ酸，成長因子およびホルモンのような成分で補足される。…好ましい具体例では，基本培地は，動物細胞培養で習熟者に知られている以下の成分で補足される。インシュリン，トランスフェリン，トリヨードチロニン（Ｔ３），および補足についての濃度および置換が，習熟者によって決定されうる，いずれかまたは両方のエタノールアミンおよびｏ－ホスホリル－エタノールアミン。」（【００３５】），及び，「インシュリンは，多重継代より長期間利点を供するグルコースおよびアミノ酸の摂取を促進するポリペプチドホルモンである。インシュリンまたはインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）の補足は，グルコースおよびアミノ酸を取込む細胞の能力の最終的枯渇，および細胞表現型の可能性のある分解がある場合に長期培養に必要である。…」（【００３６】）との記載をみても，インスリンが，同等に例示されているトランスフェリンやトリヨードチロニン等の他の動物細胞培養で習熟者に知られている成分と対比して，細胞外マトリックスの産生において異なる役割を果たすことは記載されていない。 そうすると， いるトランスフェリンやトリヨードチロニン等の他の動物細胞培養で習熟者に知られている成分と対比して，細胞外マトリックスの産生において異なる役割を果たすことは記載されていない。 そうすると，実施例における培地に含まれている，インスリン以外のハイドロコーチゾン，トランスフェリン，トリヨードサイロニン，セレン等の多 数の成分の中から，インスリンのみが，その他の成分の存在にかかわらず細胞外マトリックスの産生において，重要な役割を果たすことの根拠は見出せない。 そして，前記３(2)によれば，無血清培地に添加される血清代替成分については，インスリン，トランスフェリン，セレン等の複数の成分を同時に添加することが周知であるということができるから，実施例の無血清培地に含まれる多数の成分の中から，インスリンのみを選択して，所定の効果を果たすための重要な成分として本願発明の発明特定事項とすることの根拠は見出せない。 したがって，本願明細書の記載及び本願優先権主張日当時の技術常識から，実施例で確認された効果が，トランスフェリンやセレン等の他の成分を含まない本願発明の全体にわたって奏される効果ということはできないから，本件審決がした認定判断に誤りはなく，原告の上記主張は採用することができない。 (3) 小括以上によれば，原告主張の取消事由１－(2)は理由がない。 ５ 取消事由２（本件審決の手続違背）について(1) 原告は，相違点３の判断において，本件審決が周知技術を示すものとして引用した刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）は，いずれも本願の審査及び審判段階で示されたことがなく，本件審決で初めて示された文献であるところ，本件審決では，相違点３の容易想到性に関して，刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用し，「無血清培地で ７）は，いずれも本願の審査及び審判段階で示されたことがなく，本件審決で初めて示された文献であるところ，本件審決では，相違点３の容易想到性に関して，刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用し，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であると認定し，刊行物Ｌ（甲５）を引用し，「線維芽細胞を無血清で培養できること」が技術常識であると認定し，かかる周知の事項に基づいて，引用発明において無血清で培養することは，当業者に容易であると判断したものであるが， これは，刊行物Ｌ～Ｎ（甲５～７）を，単に当業者の技術水準を知るためや，先行文献に記載された事項の技術的意義を明確にするなど補助的に用いたものではなく，相違点３の容易想到性を肯認する判断の核心的な引用例として用いたものであって，本件審決の上記認定判断が「査定の理由と異なる理由」に該当し，原告には，上記認定判断に基づく相違点３の構成の容易想到性について，実質的な防御の機会が与えられておらず，意見書提出の機会を与えなくとも手続の公正及び原告の利益を害さない等の特段の事情が存しないことは明らかであるから，本件審決の審判手続は，特許法１５９条２項で準用する同法５０条の規定に違反するものであり，かかる違反は，本件審決の結論に影響を及ぼす旨主張する。 そこで，この点について，以下検討する。 (2) 証拠（甲１５，１６）及び弁論の全趣旨によれば，以下の事実が認められる。 ア特許庁は，原告に対し，平成２５年３月１２日付けで拒絶理由を通知したが，当該拒絶理由通知書（甲１５）には，相違点３の容易想到性について，次の記載がある。 「ウ相違点３について従来より,血清には，価格変動や供給不安があ けで拒絶理由を通知したが，当該拒絶理由通知書（甲１５）には，相違点３の容易想到性について，次の記載がある。 「ウ相違点３について従来より,血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２の摘記（刊２－１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３－１）参照。）等の欠点が有ることが知られており，本願優先権主張日前から無血清培地での培養が周知の課題となっていた。 そして，無血清で培養する際，インスリンを添加することは周知の事項であった（刊行物２の摘記（刊２－２）参照。）そうすると，刊行物１発明において，無血清で培養すべくインスリンを添加して本願発明１のごとく構成することは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえる。」（２５，２６頁） イこれに対して，原告は，平成２５年９月１８日付け意見書（甲１６）を提出した。当該意見書には，相違点３の容易想到性について，次の記載がある。 「また，刊行物２及び３は，血清には，価格変動や供給不安があること及びロット間でばらつきがあること等の欠点が有ることを指摘しているに過ぎず，あらゆる細胞が，血清含有培地と同様に，無血清培地でも培養することができることについての技術的知見は全く存在せず，まして，血清含有培地と同様に，無血清培地で培養することにより，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについて何らも触れられていません。 しかも，刊行物２及び３で指摘されている上記欠点は，発明の「商業的実施」という観点から問題とされるものであり，「技術的実施」という観点から問題とされるものではありません。即ち，血清について，価格変動や供給不安があり，あるいはロット間でばらつきがあるとしても，そのこと自体は， 点から問題とされるものであり，「技術的実施」という観点から問題とされるものではありません。即ち，血清について，価格変動や供給不安があり，あるいはロット間でばらつきがあるとしても，そのこと自体は，細胞の種類を問わず，血清含有培地と同様に，無血清培地で培養することが可能であり，また，細胞を培養により，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについての技術的根拠とはなり得ず，また，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果（商業的実施ではない。）を達成するために，血清含有培地に替えて，無血清培地で培養することについての示唆等となるものでもありません。 かかる刊行物１～３の記載に鑑みれば，刊行物２及び３の記載より，本願優先権主張日前から無血清培地での培養が周知の課題となっていたとしても，当業者は，牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましいことが記載されている刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養した場合に，細胞と細胞外マトリックスとから なる組織が形成されると予測することは全くあり得ず，その結果，当業者は刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養することを想起することは全くあり得ません。」（３頁）ウしかして，本件審決は，相違点３の容易想到性について，次のとおり認定判断した。 「３ 相違点３について（１）インシュリンの添加について従来より，血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２の摘記（刊２－１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３－１）参照。），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－１））等の欠点があることが知られてお 摘記（刊２－１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３－１）参照。），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－１））等の欠点があることが知られており，本願優先権主張日前から無血清培地で培養することが周知の課題となっていた。 そして，無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のあるインスリンを無血清培地に添加することは周知の事項であった（刊行物２の摘記（刊２－２），刊行物Ｋの摘記（刊Ｋ－１），刊行物Ｌの摘記（刊Ｌ－２），刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ－１）参照。）。 さらに，刊行物１において，「…」と記載されており，血清の入った培地であるが，腱線維芽細胞の培養において，インスリンを添加した培地で，細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンの合成が盛んなることを確認しており，インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる。 そうすると，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加する程度のことは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえる。 （２）細胞外マトリックスの産生について 無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項（例えば，刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ－１））であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた。 そして，線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように，古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった。 無血清培地で細胞外マトリックスが必ず産生されるとまでは分からないとしても，引用 培養することは，刊行物Ｌに記載のように，古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった。 無血清培地で細胞外マトリックスが必ず産生されるとまでは分からないとしても，引用発明のごとく血清添加培地では細胞外マトリックスが産生されており，かつ，無血清培地でも物質生産ができるという上記技術常識に照らせば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることは明らかである。 そして，本願発明は，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加し，細胞外マトリックスが無血清培地で期待どおり産生されることを確かめることで，相違点３に記載の本願発明の特定事項のごとくしたものであって，細胞外マトリックスが産生されることを確かめることは，当業者が何の創作性もなくなし得る単なる確認事項にすぎない。 」（２９～３１頁）(3) 本件審決が，刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用したことについて前記(2)認定事実によれば，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書（甲１５）においては，「無血清で培養する際，インスリンを添加することは周知の事項であった（刊行物２の摘記（刊２－２）参照。）」ことは記載されているものの，「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うこと」についての具体的な言及はされていない。これに対して，本件審決では，「（１）インシュリンの添加について」とは別に「（２）細胞外マトリックスの産生について」の項目を立てた上で，無血清培地で細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることの根拠として，「無血清 培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項（例えば，刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－２）及び刊行物Ｎの摘 当業者に抱かせることの根拠として，「無血清 培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項（例えば，刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ－１））であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた。」ことが記載されている。 しかしながら，前記３(2)で検討したように，多数の文献において，インスリンを含む無血清培地を用いて，動物細胞を培養し，細胞の維持又は細胞数の増加や生物学的に活性な物質の産生を行ったことが記載されていることからすれば，一方において，乙１に「培養細胞が増殖と分化・機能発現とを同時に行わない可能性もある.」と記載されているように，培養細胞を培養した際に，増殖が生じたとしても，同時に，生物学的に活性な物質の産生のような分化・機能発現も生じるとは限らないことが広く知られているにしても，一般に，培地を用いて細胞を「培養する」とは，細胞を維持・増殖させることに限定して使用される用語ではなく，これに加えて，それが成功するかどうかは別として，生物学的に活性な物質を産生させることをも包含する概念として使用されているということができる。このことは，拒絶理由通知書（甲１５）において引用されている刊行物２（甲２）の段落【０００７】に，「したがって，細胞の生長および生物学的に活性な産物の生産を支持するための代替の培地補助剤の開発が強く望まれている。」と記載されていることによっても示されているということができる。そうすると，拒絶理由通知書（甲１５）の「無血清で培養する際」との上記記載は，細胞を維持・増殖させることに加えて，細胞から生物学的に活性な物質を産生させることをも包含する趣旨であることは，当業者であれば容易に理解し得る自明なことというべきで 清で培養する際」との上記記載は，細胞を維持・増殖させることに加えて，細胞から生物学的に活性な物質を産生させることをも包含する趣旨であることは，当業者であれば容易に理解し得る自明なことというべきである。 そして，本件審決の「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項（例えば，刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ－２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ－１））であり，無血清培地 でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた。」との上記記載は，拒絶理由通知書（甲１５）の「無血清で培養する際」との記載を，具体的に説明し，無血清で培養し，蛋白質等の物質生産を行うことも周知であったことを明らかにしたものにすぎないということができる。そうすると，本件審決が，初めて刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用して，上記記載を追加したとしても，これが拒絶理由通知（甲１５）とは異なる拒絶理由を構成したということはできない。 加えて，前記(2)のとおり，原告は，拒絶理由通知（甲１５）に対する意見書（甲１６）において，「刊行物２及び３は，…指摘しているにすぎず，あらゆる細胞が，血清含有培地と同様に，無血清培地でも培養することができることについての技術的知見は全く存在せず，まして，血清含有培地と同様に，無血清培地で培養することにより，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについて何らも触れられていません。」，「細胞の種類を問わず，血清含有培地と同様に，無血清培地で培養することが可能であり，また，細胞を培養により，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについての技術的根拠とはなり得ず，また，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果（商業的実施ではない。 を培養により，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについての技術的根拠とはなり得ず，また，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成するという技術的結果（商業的実施ではない。）を達成するために，血清含有培地に替えて，無血清培地で培養することについての示唆等となるものでもありません。」と記載するなどして，明らかに，「無血清培地で，蛋白質等（具体的には，細胞外マトリックス）の物質生産を行うこと」は示唆されていない旨主張しているのであるから，刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）が，本件審決において初めて引用された文献ではあるものの，すでに原告は，意見書において「無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うこと」についての意見を述べているということができるから，実質的に防御の機会が与えられていなかったということもできない。 (4) 本件審決が，刊行物Ｌ（甲５）を引用したことについて 前記(3)で検討したところによれば，本件審決の，刊行物Ｌ（甲５）を引用した上でした，「線維芽細胞を無血清で培養することは，…技術常識であった。」との認定は，拒絶理由通知書（甲１５）の「無血清で培養する際，インスリンを添加することは周知の事項であった」ことが，線維芽細胞においても当てはまることを補足的に説明したものであるというべきであるから，拒絶理由通知（甲１５）と異なる拒絶理由を形成するものではない。 また，前記(2)のとおり，原告は，意見書（甲１６）において，「あらゆる細胞が，血清含有培地と同様に，無血清培地でも培養することができることについての技術的知見は全く存在せず」と主張しており，これは，線維芽細胞を含めたあらゆる細胞を無血清で培養することについての意見を述べたものであるから，本件審決の上記認定について実質的な防御の機会 についての技術的知見は全く存在せず」と主張しており，これは，線維芽細胞を含めたあらゆる細胞を無血清で培養することについての意見を述べたものであるから，本件審決の上記認定について実質的な防御の機会が与えられていなかったということもできない。 (5) 原告の主張について原告は，この点について，意見書（甲１６）では，原告は，専ら血清含有培地における課題の周知性が，相違点３の構成の容易想到性の根拠とはなり得ない旨の反論を述べただけであり，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であること，「線維芽細胞を無血清で培養すること」が技術常識であること及びこれに基づく相違点３の構成の容易想到性についての意見は述べていないから，これらを周知事項及び技術常識とした認定判断及びこれに基づく相違点３の構成の容易想到性について，原告には，実質的な防御の機会が与えられていない旨主張する。 しかし，前記のとおり，原告は，意見書（甲１６）において，血清含有培地における課題の周知性に関する反論以外にも，「無血清培地での蛋白質等（具体的には，細胞外マトリックス）の物質生産を行うこと」に関する意見を，実質的に述べているということができる。 したがって，原告の上記主張は採用することができない。 (6) 小括以上によれば，本件審決が，相違点３の容易想到性に関して，平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書においては示していなかった刊行物Ｍ，Ｎ（甲６，７）を引用し，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であると認定し，刊行物Ｌ（甲５）を引用し，「線維芽細胞を無 ６，７）を引用し，「無血清培地で蛋白質等の物質生産を行うこと」が周知の事項であり，「無血清培地でも蛋白質等の物質生産できること」が技術常識であると認定し，刊行物Ｌ（甲５）を引用し，「線維芽細胞を無血清で培養できること」が技術常識であると認定し，かかる周知の事項に基づいて，引用発明において無血清で培養することは，当業者に容易であると判断したことについて，特許法１５９条２項で準用する同法５０条の規定に違反する違法な手続があったということはできない。 したがって，原告主張の取消事由２は理由がない。 ６ 結論以上のとおり，原告主張の取消事由はいずれも理由がなく，本件審決にこれを取り消すべき違法は認められない。 よって，原告の請求は理由がないから，これを棄却することとし，主文のとおり判決する。 知的財産高等裁判所第４部 裁判長裁判官富田善範 裁判官田中芳樹 裁判官柵木澄子
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